Zárt koponyaablak altatott patkányon

Módszerek

Felnőtt, hím Sprague-Dawley patkányokat (260-380 g; Harlan UK Ltd., Bicester, U.K.; n=6) 1,5-2,0 % halotánnal altattunk N2O:O2 gázkeverék 2:1 arányú elegyében belélegeztetve. Az állatok a kísérletek során spontán lélegeztek. Testhőmérsékletüket rektális hőmérővel monitoroztuk, és visszacsatolásos elven szabályozott melegítőpárnával 37,1 és 37,4 ^oC között tartottuk (Harvard Apparatus, Holliston, MA, U.S.A.). Az állatok fejét sztereotaxiás befogóba rögzítettük, majd fogorvosi fúró segítségével (Technobox 810, Bien-Air Dental S.A., Bienne, Svájc) a teljes jobboldali parietális koponyacsontot eltávolítottuk. A fúrófejet fiziológiás sóoldattal folyamatosan hűtöttük.

A csontperemen zárt koponyaablakot alakítottunk ki (4.1.3. ábra): fogászati cementtel megmagasítottuk a csarnok oldalát, amely magában foglalt egy bevezető és egy kivezető polietilén csövet mesterséges cerebrospinális folyadék áramoltatására (artificial cerebrospinal fluid, aCSF).

Beépítettünk továbbá a csarnok mediális falába egy mikrodialízis pumpával (CMA/100, CMA/Microdialysis, Solna, Svédország) összekötött, nyílásával közvetlenül az agykéreg fölé

pozícionált üveg kapillárist, amely a későbbiekben 1 l 1 M KCl kifecskendezése révén SD kiváltására szolgált. A koponyaablakot feltöltöttük aCSF-fel (az oldat összetétele: 126,6 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,5 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 24,5 mM NaHCO3-, 6,7 mM urea, 3,7 mM glükóz, 95 % O2 és 5 % CO2 gázelegyével buborékoltatva), a kemény agyhártyát óvatosan eltávolítottuk, majd az ablakot mikroszkópos fedőlemezből méretre vágott (17 × 11 mm) üveg lemezzel zártuk le. A fedőlemezbe előzetesen egy 1 mm átmérőjű lyukat fúrtunk az SD kiváltási helyétől 2-3 mm-re anterior irányba, melyen kemm-resztül az ablakba elektródát és lézer-Doppler szondát építettünk be.

4.1.3. ábra. Zárt koponyaablak kialakítása a patkány parietális agykérge felett. Rövidítések: aCSF:

mesterséges cerebrospinális folyadék (artificial cerebrospinal fluid); LDF: lézer-Doppler áramlásmérő (Laser-Doppler flowmetry); SD: agykérgi terjedő depolarizáció (spreading depolarization).

Elektrofiziológiai regisztrátumok elvezetésére egy aCSF-fel feltöltött üveg kapilláris elektródát (hegyének külső átmérője: 20 m) vezettünk 22,5^o-os szögben 1,2-1,4 mm mélyre az agykéregbe.

Referenciaként a nyak bőre alá beültetett Ag/AgCl elektróda szolgált. Az agyi vérátáramlás (cerebral blood flow, CBF) változásainak követésére az elektróda mellé lézer-Doppler szondát helyeztünk (Probe 411, PeriFlux 5000; Perimed UK Ltd., Bury St Edmunds, U.K.). A szondát a kérgi felszín közvetlen közelében úgy pozícionáltuk, hogy piális erektől mentes területet monitorozhasson. Az elektróda és a szonda bevezetésére szolgáló lyukat végül fogorvosi cementtel zártuk le úgy, hogy a látótérből minimális területet takarjon ki. A zárt koponyaablakban a fiziológiás koponyaűri nyomásnak megfelelő viszonyokat úgy reprodukáltuk, hogy a kivezető polietilén cső végét kb. 6 cm-rel az agyfelszín fölé emeltük. A koponyaablakban az aCSF-et folyamatosan, 25 l/min sebességgel, egy perisztaltikus pumpa segítségével áramoltattuk (Gilson Minipuls 3, Anachem Ltd., Luton, U.K.). A lézer-Doppler jelet digitalizáltuk, és a DC potenciállal együtt, az in vitro csirke retina preparátumnál leírtakkal azonos módon erősítettük, szűrtük, tároltuk, és jelenítettük meg. A CBF változásokat relatív formában fejeztük ki a felvételek első 5 percét 100 %-nak, a szívmegállást követő jelet 0 %-nak tekintve.

A mezőpotenciál változásainak optikai megjelenítéséhez az in vitro csirke retina preparátumnál bemutatott RH-1838 festékoldattal inkubáltuk az agykérget. Az RH-1838 oldatot a koponyaablakban 80 l/min áramoltatási sebességgel, 2 órán át keringettük, majd a fennmaradó festéket aCSF átáramoltatásával, 35 perc alatt mostuk ki. Az optikai képalkotás követte az in vitro csirke retina preparátumnál leírt módszereket, a következő módosításokkal. A digitális kamerát egy makro lencsével szereltük fel (2 × nagyítás, CCS SE-16SMS; Firstsight Vision, Tongham, U.K.), és a megvilágító LED fényforrást sávszűrővel egészítettük ki (620-640 nm; 3RD620-640, Omega Optical Inc., U.S.A.). Az expozíciós időt 100 ms-ra csökkentettük, és a festéket gerjesztő megvilágítást felvillanó módban, az expozíciós időre korlátoztuk. Végül a képsorok felvételének időtartamát 10 perce emeltük. Kísérletenként 4, egymást követő SD-t regisztráltunk, melyeket 15-21 percenként váltottunk ki.

A képsorok analízise az in vitro csirke retina preparátumnál leírtak szerint történt. A felvett SD események közül minden egyes kísérletből az első (SD1) és a második (SD2) eseményt elemeztük részletesen, mivel a csatolt vérátáramlási válaszok kinetikája a két egymást követő eseményre

nézve eltért, míg a harmadik és negyedik SD lefutása az SD2-vel megegyező volt.¹⁵ Mivel az RH-1838 az idő múlásával lineáris fakulást mutatott, a 10 perces képsorokból kapott intenzitás görbéket a fakulás meredekségének és a tengelymetszetének ismeretében korrigáltuk. A változások számszerűsítéséhez a következő jellemzőket mértük meg: a depolarizáció fél amplitúdónál mért időtartama, a depolarizáció és a repolarizáció kialakulásának sebessége, a hiperpolarizáció relatív amplitúdója, és az SD terjedési sebessége. A kapott eredményeket átlag±stdev formában adtuk meg. A statisztikai analízishez SPSS szoftvert használtunk (IBM SPSS Statistics for Windows, Version 20.0, IBM Corp., U.S.A.); egyszempontos varianciaanalízist (ANOVA) alkalmaztunk, melyet több csoport esetén Fisher post hoc teszt követett (szignifikancia küszöbe: p<0,05).

Eredmények, és azok értelmezése

A csirke retina preparátumon tapasztaltakhoz hasonlóan, az RH-1838-al feltöltött patkány agykérgen is az RH-1838 fluoreszcencia-intenzitásának tranziens fokozódása jelezte az SD-ket (4.1.4. ábra). Az intenzitásemelkedés az SD-re korábbról ismert és jellemző sebességgel^227,351 haladt át a látótéren (e.g. SD2: 3,28±0,31 mm/min, n=6).

4.1.4. ábra. Terjedő depolarizáció (SD) áthaladása a látótéren a feszültségfüggő festékkel (RH-1838) feltöltött patkány agykérgen. A: A zárt koponyaablak elhelyezkedése a parietális kéreg felett. B: A koponyaablak területén feltárt kérgi felszínt mutató reprezentatív fotó. C: Az agykérgi fluoreszcencia megjelenítése a képalkotó rendszerrel RH-1838 inkubációt követően. Az SD kiváltására használt üveg kapilláris hegye a kép bal felső sarkában látszik. C1-15: Reprezentatív képsor az SD optikai megjelenítésére feszültségfüggő festékkel. A képsort háttérkivonással és a kontraszt optimalizálásával kaptuk.

Az RH-1838 fluoreszcenciát a DC potenciálhoz hasonlítva megállapítható, hogy a depolarizáció és a repolarizáció fázisát megközelítőleg azonos módon jelezték (4.1.5. ábra). Bár az RH-1838 fluoreszcencia számszerűsítve lassabb depolarizációt és gyorsabb repolarizációt jelölt, az SD időtartama az RH-1838-ra és a DC potenciálra nézve azonos volt (4.1.1. táblázat). Ugyanakkor az SD-t követő hiperpolarizáció maximális relatív kitérése RH-1838 esetén jelentősen meghaladta a DC potenciál elvezetéssel regisztráltat (4.1.1. táblázat), és ennek függvényében a jel késleltetve tért vissza az SD-t megelőző alapértékre (4.1.5. ábra). Az RH-1838 fluoreszcencia és a DC potenciál között eltérés adódott az SD-t közvetlenül megelőző, rövid hiperpolarizáció megjelenítésében is.

A DC potenciál megbízhatóan kirajzolta, míg az RH-1838 fluoreszcencia nem jelölte a depolarizációt megelőző, azzal ellenirányú rövid potenciálváltozást (4.1.5. ábra).

4.1.5. ábra. A feszültségfüggő festék (RH-1838) fluoreszcenciájának intenzitásváltozása az idő függvényében, a patkány agykérgen átvonuló terjedő depolarizáció (SD) alatt. Az RH-1838 fluoreszcenciát a DC potenciál és az agyi vérátáramlás (cerebral blood flow, CBF) változásával vetettük össze. A DC potenciál SD-t jelölő tranziens, negatív kitérését felfelé ábrázoltuk, hogy az optikai jelekkel egyirányba mutasson, és azokkal közvetlenül összehasonlítható legyen. A kiváltott négy SD közül az elsőt (SD1) és a másodikat (SD2) ábrázoltuk. Az idősorokat több kísérletből származó esemény átlagolásával kaptuk (n=6, minden vonaldiagrammra nézve).

A vérben található hemoglobin nagyon erős fényelnyelő molekula. Annak megállapítására, hogy a hemoglobin fényelnyelése módosítja-e az RH-1838 fluoreszcenciát, az SD-t követő CBF változást is kiértékeltük (4.1.5. ábra). Megfigyeltük, hogy kísérleti modellünkben, korábbi beszámolókkal összhangban,²²⁵ az SD-ket markáns, tranziens hiperémia követte. A CBF változás görbéit úgy illesztettük a mezőpotenciál-változást jelölő diagramokhoz, hogy megmértük az RH-1838 intenzitásértékeihez használt ROI és az LDF szonda közötti távolságot (1,32±0,31 mm;

n=6), valamint az SD-k terjedésének sebességét (SD1: 3,20±0,69 mm/min, SD2:

3,28±0,31 mm/min; n=6). Ezzel a megközelítéssel a hiperémia csúcsa egybeesett a hiperpolarizáció minimumpontjával (4.1.5. ábra). A számítások során apró pontatlanságot okozhatott, hogy nem tudtuk figyelembe venni az LDF szonda dőlési szögét (így a szövetet megvilágító lézernyaláb beesési szögét), és nem tudtuk megbecsülni azt a szöveti térfogatot, amelyből a CBF szignál ténylegesen keletkezett. Ezek figyelembevételével elképzelhető, hogy a hiperémia csúcsa a hiperpolarizáció minimumához képest kicsit késve jelentkezhetett.

4.1.1. táblázat. A patkány agykérgen kiváltott terjedő depolarizáció (SD) RH-1838 festékkel és DC potenciállal kapott kinetikájának számszerűsített jellemzése.

Az adatokat átlag±stdev formában adtuk meg. A statisztikai értékeléshez egyszempontos variancia-analízist (ANOVA) használtunk (p<0,05*; p<0,01**).

Mérlegeltük annak a lehetőségét is, hogy az RH-1838 fluoreszcenciája és a DC potenciál közötti eltérést okozhatja, hogy a kéreg nem ugyanazon rétegét monitoroztuk. Az üveg kapilláris elektróda hegyét a kéregbe 1,2-1,4 mm mélyre ültettük be, de arra vonatkozóan nem állt rendelkezésre adat, hogy a kérgi felszínre mosott RH-1838 a kéregbe milyen mélyen penetrál. Erre a célra az egyik állat agyából a kísérlet végén, 1 mm vastag koronális metszeteket készítettünk a koponyaablak magasságában, majd a képalkotó rendszerrel felvett fluoreszcens képeken meghatároztuk a fluoreszcencia-intenzitást a felszínre merőlegesen lefelé haladva, a kéreg teljes

mélységében (4.1.6. ábra). A vizsgálat megmutatta, hogy az RH-1838 a kéreg felső, 700 m vastag rétegében halmozódott fel, legintenzívebben a felszín alatti 100-200 m mélységű szövetréteget jelölte.

4.1.6. ábra. A feszültségfüggő festék (RH-1838) mélységi eloszlása az agykéregben.

Egy kísérlet végén az agyat a koponyából eltávolítottuk (A), majd a képalkotó rendszerrel rögzített fluoreszcens felvétel (gerjesztés: =620-640 nm, emisszió: >670 nm) segítségével igazoltuk a koponyaablak helyét (B). Az RH-1838 mélységi eloszlását egy reprezentatív koronális metszeten mutatjuk be (C). A fluoreszcencia-intenzitást a kérgi felszínre merőlegesen mértük (D). Az RH-1838 felhalmozódása a felső rétegekben a felvételeken már jól megfigyelhető (E).

Méréseinket a szürkeszint alaptól való eltéréseként ábrázoltuk az agyfelszíntől mért távolság függvényében (F).

Eredményeink szerint az RH-1838 feszültségfüggő festék alkalmas az SD valós idejű, közvetlen képi megjelenítésére. Az SD-t tükröző RH-1838 szignál jól reprodukálható, ideális, magas jel-zaj viszony jellemzi, és megfelelő térbeli és időbeli felbontással rendelkezik. A legfontosabb tulajdonsága, hogy a DC potenciálváltozásokkal analógnak mutatkozott, ami alapján ez az új képalkotó módszer - adott korlátok között - a DC potenciál elvezetésnek minden időpontban vett két dimenziójú megfelelőjének tekinthető.

Megfigyeléseink jelzik, hogy az RH-1838 fluoreszcenciát a mezőpotenciáltól független folyamatok is zavarhatják, viszont ezek súlya az SD monitorozása és a jelfeldolgozás során elfogadható határon belül maradt. A festék elhagyásával megismételt in vitro kísérleteink bizonyították, hogy endogén fluoreszcens források nem járultak hozzá, illetve nem módosították az RH-1838 fluoreszcenciáját. A patkány agykérgen végzett megfigyeléseink szerint a hemoglobin, mint fényelnyelő molekula, viszont befolyásolta a mért RH-1838 fluoreszcenciát, hiszen a fluoreszcens felvételeken a fényelnyelés révén a piális érhálózat sötéten rajzolódott ki (4.1.4. ábra, C panel). Ez a megállapítás azért lényeges, mert az SD-hez egy markáns, áramlásnövekedés társul, ezért a hemoglobin fényelnyelése az SD során a hiperémia kialakulásával jelentősen növekszik, csökkentve az RH-1838 fluoreszcencia intenzitását. Eredményeink szerint az SD-re válaszként kialakuló hiperémia csúcsa időben egybeesik az SD-t követő hiperpolarizáció fázisával (4.1.5. ábra), és az így megnövekedett fényelnyelés miatt jelöl az RH-1838 jóval kifejezettebb hiperpolarizációt illetve fokozatosabb visszatérést az alapvonalra, mint a DC potenciál. A hemoglobin csökkentheti az RH-1838 gerjesztését a megvilágító fény részleges abszorpciójával, de ugyanilyen elven az emissziót is tompíthatja. Végül számításba vettük, és felvételeinkkel igazoltuk az RH-1838 korábban már leírt, megvilágítástól függő fakulását.¹⁴⁹ Mivel a fakulás az adott időablakra (10 perc) nézve lineárisnak mutatkozott, a fluoreszcencia-intenzitás fokozatos csökkenésére matematikailag korrigáltuk a kapott görbéket.

Az eredmények újszerűsége, a kutatás távlatai

A kutatókat már régóta foglalkoztatta az SD megfigyelése képalkotó eljárások segítségével azért, hogy az SD kísérletes modellekben valós időben, két képi dimenzióban megjeleníthetővé váljon, és így terjedésének térbeli tulajdonságai tanulmányozhatóak legyenek. A korábban kidolgozott megközelítések viszont olyan változók rögzítésével értek el eredményt, amelyek az SD-hez társuló áramlási vagy metabolikus válaszokat monitorozták, az SD-t magát nem. Így például a CBF lokális változásainak lézer-folt interferencián alapuló képi megjelenítése jól láttatja az SD áthaladását a kérgi felszínen,112,225,358 hiszen az SD-t követő CBF változás térben ugyanúgy terjed, mint maga az SD.121,284,298 Hasonlóképpen, az SD-vel járó, és a CBF-el jól korelláló lokális vérvolumen-változást, illetve az oxigén-felhasználást jelölő hemoglobin-deszaturációt is meg lehet képalkotással figyelni.^18,54,113 Végül a sejtek redox állapotát tükröző, a NADH autofluoreszcenciáján alapuló képalkotó módszert is kidolgoztak az SD követésére.253,372,381 Bár a felsorolt módszerek létjogosultsága és alkalmazhatósága vitathatatlan, az SD tekintetében mégis közvetettnek tekintendők, hiszen társuló (kór)élettani jelenségeket vizsgálnak. A hemodinamikai változók például az SD megőrzött kinetikája mellett is nagy variabilitást mutatnak a szövet metabolikus állapotának függvényében,¹⁶ ezért monitorozásuk nem ad az SD-re vonatkozó, megbízható információt. Az általunk kidolgozott, és itt bemutatott, feszültségfüggő festék fluoreszcenciáján alapuló képalkotás közvetlenül az extracelluláris eredetű DC potenciálnak feleltethető meg. Az SD-re jellemző, negatív, tranziens DC kitérést a festék fluoSD-reszcencia-intenzitásának időben azonos lefutású növekedése jelöli.

A feszültségfüggő festéket eddig a látókéreg, hallókéreg és a szomatoszenzoros kéreg funkcionális szerveződésének feltérképezésére használták.55,130,148,276 Szintén sikeresen alkalmazták epilepsziás görcsaktivitás fókuszának azonosítására,^240,304 és gátló GABA aktivitás keletkezésének és terjedésének követésére.^49,86 Eredményeink alapján ez az optikai képalkotó eljárás ígéretes az agykérgi iszkémiás sérülések patogenezisének tanulmányozására, és különösen az infarktus időbeli és térbeli növekedésének követésére a stroke különböző állatmodelljeiben.

A fejezethez vonatkozó eredeti közlemény:

Farkas E, Pratt R, Sengpiel F, Obrenovitch TP.Direct, live imaging of cortical spreading depression and anoxic depolarisation using a fluorescent, voltage-sensitive dye.J Cereb Blood Flow Metab. 2008;28(2):251-62.