Az agykérgi terjedő depolarizációval járó szöveti acidózis: tranziens globális előagyi

Háttér

Az agyi metabolizmus intenzitásának becsléséhez leginkább a szöveti glukóz, laktát és piruvát koncentráció mérésére támaszkodnak, de a szöveti pH is hasznos támpontként szolgál. A szénhidrátok metabolizmusa során CO2 és laktát képződik, amely hozzájárul az interstíciális folyadék savasodásához. A neuronok működésével továbbá erősen savas tartalmú szinaptikus vezikulák ürülnek az extracelluláris térbe, ami tovább csökkentheti az extracelluláris tér pH-ját. Az agyi interstícium kémhatásának savas irányú eltolódását a különböző puffer rendszerek – mint a szénsav-anhidráz enzim rendszer – ellensúlyozzák, valamint az intra- és extracelluláris tér közötti pH különbséget proton pumpák egyenlítik ki.⁵⁸

A hatékony pufferrendszerek ellenére a neuronális aktivitás fokozódása szinte késés nélkül átmeneti szöveti acidózist von maga után, így az idegszövet pH változásait a neuronális metabolizmus érzékeny indikátorának tekintik.⁵⁹ A súlyos mértékű acidózis ugyanakkor szövetkárosító hatású, mert módosítja az idegsejtek ingerelhetőségét, előmozdítja a szabadgyökök termelődését, gátolja az intracelluláris szignalizációs folyamatokat, és DNS-töredezést indukál.³⁴⁶ Az ép keringésű patkány agykéregben az SD alatt a szöveti pH átmenetileg 7,35-ről 6,90-6,95-re csökken (4.3. fejezet), ami mértékét és rövid időtartamát tekintve valószínűleg nem káros a neuronokra nézve. Azonban az SD-okozta pH változás a neuronok sérülése szempontjából meghatározó lehet, ha az SD az iszkémiás agykéregre jellemzően rövid időn belül többször ismétlődik, és az SD-vel járó acidózis hozzáadódik az iszkémiás penumbrát jellemző pH 6,9 körüli értékű acidózishoz.²³⁷ Kísérleteinket tehát az a hipotézis vezérelte, hogy az SD-re jellező savas pH változás az iszkémiás agyban fellépő szöveti acidózist elmélyíti, és a szövetkárosító tartományba tolja el. Elképzelésünket alátámasztja, hogy az SD-t kísérő szöveti laktát-felhalmozódás iszkémia során jelentősebbnek bizonyult az ép agykéregben tapasztalthoz képest.³³⁵ Hipotézisünk igazolására patkány iszkémia modellben pH-szenzitív mikroelektródát, és optikai, pH-alapú illetve CBF képalkotást alkalmaztunk (4.3. fejezet).

A kísérleti modell az eddig beállított iszkémia modellektől annyiban tért el, hogy az iszkémiára válaszult kialakuló, spontán SD-ken túl kísérletesen további SD-ket is kiváltottunk. Az SD-k kontrollált kiváltásának előnye, hogy időzítésük kiszámítható, az események közötti változatosság minimális, és az ép agykéregben kiváltott SD-khez hasonlítva az iszkémiás SD-kre jellemző eltérések közvetlenül, megbízhatóan értékelhetők.

Módszerek

Kísérleteinket fiatal felnőtt (2 hónapos), hím, Sprague-Dawley patkányokon végeztük (n=20). A kísérleti állatok előkészítését, a pH-szenzitív mikroleketródák alkalmazását, ezzel egyidejűleg a lézer-Doppleres áramlásmérést, és a szöveti pH-t és CBF változásokat monitorozó optikai képalkotó eljárást a 4.3. fejezetben részletesen ismertettük. A globális előagyi iszkémia kialakítására a CCA-t mindkét oldalon kipreparáltuk (5.3. fejezet), majd házilag készített műanyag okklúdereket fűztünk az erek köré, hogy az artériákat a kísérleti protokoll egy adott fázisában elzárjuk. Az állatok egy csoportjában az agykérgi pH változásokat ionszenzitív mikroelektródával, egy másik csoportban pH alapú multi-modális képalkotással regisztráltuk (4.3. fejezet).

Ötven perces alapszakasz felvétele után a CCA-kat elzártuk (2VO), majd egy óra elteltével az érelzárás feloldásával reperfúziót hoztunk létre. A kísérleteket egy újabb óra elteltével izoflurán túldozírozásával fejeztük be. A kísérlet három fázisa során (alap, iszkémia, reperfúzió) egyenként 3-3 SD-t váltottunk ki 15 perces időközönként (4.3. fejezet) (5.4.1. ábra). A kísérletek egy részében a 2VO után perceken belül egy spontán SD is megjelent (5.4.1. ábra).

A részletes analízis során a spontán és kísérletesen kiváltott SD-ket külön értékeltük. A kísérletesen kiváltott eseményeket a kísérletek három szakasza szerint (alap, iszkémia, reperfúzió) hasonlítottuk össze, az első SD-t (SD1) elkülönítve. A kapott eredményeket átlag±stdev formában adtuk meg. A statisztikai analízishez SPSS szoftvert használtunk (IBM SPSS Statistics for Windows, Version 20.0, IBM Corp., U.S.A.). A statisztikai értékeléshez egyszempontos ANOVA-t használtunk, melyet Fisher post hoc teszt követett.

5.4.1. ábra. A kísérleti protokoll. A számozott terjedő depolarizációs események (spreading depolarization, SD) az 1 M KCl-al, kísérletesen kiváltott SD-ket jelölik. A kísérletek egy részében, az iszkémia indukciója után közvetlenül spontán SD (sp. SD) is kialakult, melyet bizonytalan megjelenése miatt zárójelesen adtunk meg. A globális előagyi iszkémiát kétoldali arteria carotis communis elzárással (two-vessel occlusion, 2VO), a reperfúziót az érelzárás feloldásával hoztuk létre. A kísérleteket az altató túladagolásával fejeztük be.

Iszkémia alatt a terjedő depolarizációval markánsabb acidózis jár

Az ép kéregben lezajló SD-hez képest az iszkémia alatt kiváltott eseményekkel jelentősen határozottabb acidózis alakult ki, melyet jellemzett a nagyobb relatív amplitúdó (0,43±0,15 vs.

0,36±0,07 pH egységnyi változás), a hosszabb fél amplitúdónál mért idő (pH-szenzitív mikroelektróda: 93,1±26,3 vs. 40,2±8,1 s; NR képalkotás: 127,5±64,2 vs. 39,8±13,8 s), és a kiterjedtebb görbe alatti terület (AUC, area under the curve) (pH-szenzitív mikroelektróda:

2415±869 vs. 855±322 pH egység x s) (5.4.2. ábra). Az iszkémiás agykéregben SD után lassult a szöveti pH rendeződése is, melyet az acidózis visszatérő szakaszának meredeksége adott meg (pH-szenzitív mikroelektróda: 0,44±0,33 vs. 0,70±0,26 pH egység/s). A reperfúzió fázisa alatt az SD-khez tárduló acidózis a kísérlet alapszakaszára jellemző mértékűnek bizonyult (relatív amplitúdó: 0,31±0,09 vs. 0,36±0,07 pH egységnyi változás; fél amplitúdónál mért idő: 42,0±8,0 vs.

40,2±8,1 s).

Korábbi megfigyelések azt valószínűsítik, hogy az SD-vel járó acidózis a laktát szöveti felhalmozódásával függ össze.^267,332 Az SD során kialakuló laktát-acidózis valószínűségét támasztja alá az is, hogy agyi iszkémia során az idegszöveti pH csökkenése egyenesen arányos a laktát felszaporodásával.^198,283 Ezek alapján tehát azt feltételezzük, hogy az iszkémiás kéregben az SD-vel azért alakul ki markánsabb acidózis az ép kéreghez képest, mert az SD iszkémia alatt nagyobb mértékben fokozza a laktát felszaporodását. Az iszkémia alatti jelentősebb laktát termelődés mögött az állhat, hogy az SD a sérült szövetben kizárólag anaerob metabolizmust indít be,²⁸¹ míg az ép kéregben az SD-okozta metabolikus igényt kezdetben a glükóz aerob, majd később anaerob lebontása fedezi.^253,316

A terjedő depolarizációt követő hiperémia mértéke csökken iszkémia során

A kísérleti modell a látótérben (de globális természeténél fogva valószínűleg a teljes agykéregben) az iszkémiás penumbrára jellemző viszonyokat teremtett. Az érelzárás után a CBF 20-40 % között mozgott a reperfúzió megkezdéséig, mely megfelel az iszkémiás penumbra szöveti perfúziót alapul vevő definíciójának.¹⁰ Eredményeink értékelése szempontjából a penumbrára jellemző viszonyok vizsgálata nagy jelentőséggel bír, hiszen fokális iszkémiában az ismétlődő SD-k elsősorban a penumbrára nézve károsak.¹⁶⁴

A kiváltott SD eseményekhez az esetek döntő többségében hiperémia társult (5.4.2. ábra). A kísérletek iszkémiás szakaszában elvétve terjedő iszkémiát is megfigyeltünk, de a terjedő iszkémia alacsony előfordulási gyakorisága miatt ezeket statisztikailag nem értékeltük. A hiperémiás válaszok meghatározó előfodulását okozhatta, hogy az iszkémiás inzultust megelőző alap szakaszban SD-ket váltottunk ki. Az ép kéregben indukált SD-t ugyanis prekondicionáló stimulusként is számon tartják, mely növeli az iszkémiával szembeni toleranciát.³⁴¹ Elképzelhető, hogy az iszkémia súlyosabb következményekkel járt volna, ha nem előzi meg ismételt SD kiváltás.

Az SD-vel összefüggő hiperémia kezdete az acidózis kezdetét 24,5±23,5 s késéssel követte. Az iszkémia során az SD-vel járó hiperémia relatív amplitúdója jelentősen csökkent (20,8±8,9 vs.

76,3±119,6 %), hossza pedig megkétszereződött az alap szakaszhoz képest (146,4±49,7 vs.

61,4±11,6 s) (5.4.2. ábra), mely megfelel korábbi megfigyeléseknek.¹³³ A hiperémia AUC-je iszkémia alatt kisebbnek bizonyult (3009±1073 vs. 4428±1436 % x s). A hiperémia csökkenését iszkémia alatt okozhatta a neurovaszkuláris csatolás sérülése.¹⁹⁶ Ugyanakkor az iszkémia akut szakaszában a perfúzió csökkenését metabolikus vazodilatátorok, például adenozin vagy laktát gyors felszabdulása, illetve az ADP/ATP arány emelkedése követi, mely az agyi arteriolák tágulásához vezet.⁶⁵ Ebből következik, hogy az erek alaptónusának csökkenése miatt a további vazodilatáció tartománya beszűkül, mely magyarázhatja az SD-re válaszul kialakuló hiperémia kisebb amplitúdóját az iszkémiás kéregben.

A reperfúzió fázisában a hiperémia jellemzői javultak az iszkémiás szakaszhoz képest, de relatív amplitúdója és AUC-je nem rendeződött az alap szakaszra jellemző értékre (relatív amplitúdó:

46,9±25,3 vs. 20,8±8,9 vs. 76,3±119,6 %; AUC: 2788±1362 vs. 3009±1073 vs. 4428±1436 % x s;

reperfúzió vs. iszkémia vs. alap szakasz). Ez megfelel a neurovaszkuláris csatolás részlegesen fennmaradó elégtelenségének MCAO-t követő reperfúzió alatt.³⁶⁶ A reperfúzió korai szakaszában a depolarizációval összefüggő hiperémia részleges helyreállásának hátterében a periciták elhúzódó konstrikciója, és a kapillárisok gyenge átjárhatósága állhat.^152,420

A terjedő depolarizáció jelentősen elmélyíti az iszkémia-okozta idegszöveti acidózist

Kísérleteinkben az iszkémia kialakítását követően a szöveti pH átlagban 6,93±0,09-nek adódott, hasonlóan ahhoz a tartomáynhoz (i.e. pH 6,9-7,0), amit korábban kísérletes MCAO után a penumbra régióra kalkuláltak.²⁹⁰ A kísérletek egy részében, az iszkémia kialakítását követő két percben spontán SD jelentkezett. A felvett képsorok tanúsága szerint – a korábbi fejezetekben bemutatott megfigyelésekkel egyezően – az esemény frontolaterális (a később kísérletesen kiváltott SD-k kiindulási pontjával ellentétes) irányból lépett be a látótérbe (5.4.3. ábra). Az SD spontán megjelenésének kedvezett, ha az iszkémia indukciója után a CBF minimumértéke 20 % alá esett, illetve ha a szöveti pH iszkémiával összefüggő csökkenése a 0,2 pH egységnyi mértéket meghaladta (5.4.4. ábra). Érdekes módon az iszkémia indukcióját megelőző szöveti pH alkalotikusabb volt azokban az esetekben, amikor az iszkémia kezdetén spontán SD jelent meg, ahhoz képest, amikor spontán SD-t nem tapasztaltunk (pH 7,28±0,06 vs. 7,21±0,04; spontán SD megjelenése vs. elmaradása).

5.4.2. ábra. A kísérletesen kiváltott terjedő depolarizációval (spreading depolarization, SD) járó szöveti acidózis és agyi vérátáramlási (cerebral blood flow, CBF) válasz patkány agykéregben. A: Az SD-vel járó szöveti pH-változás (kék és piros) és CBF változás (fekete) a kísérlet három szakaszára lebontva (i.e. alap, iszkémia, reperfúzió). A vonaldiagramokat számos kísérletből származó SD-k átlagaként ábrázoltuk (átlag±stdev; n=6/8). A kék a pH-szenzitív mikroelektródák révén, a piros a pH-alapú optikai képalkotás eredményeként kapott pH változásokat tünteti fel. A pH-alapú optikai képalkotással a reperfúzió szakszáról nem nyertünk megbízható adatokat a neutrálvörös (Neutral Red, NR) fakulása miatt. A feltüntetett CBF változásokat lézer-Doppleres áramlásméréssel regisztráltuk. B: Az acidózis relatív amplitúdóját pH egységnyi változásként adtuk meg. C: A visszatérés sebessége az acidózisból. D: Az acidózis és a hiperémia fél amplitúdónál mért időtartama. E: A hiperémia relatív amplitúdója. A B-E paneleken az adatokat átlag±stdev formában adtuk meg, az elemszámokat az oszlopokon tüntettük fel.

A statisztikai értékeléshez egyszempontos variancia-analízist (ANOVA) használtunk (p<0,05*; p<0,01**), melyet Fisher post hoc teszt követett (p<0,05* és p<0,01** vs. alap szakasz; p<0,01^## vs. iszkémia).

A spontán SD a savas szöveti pH viszonyokat jelentős mértékben súlyosbította. Az iszkémiával összefüggő szöveti acidózishoz az SD-okozta acidózis hozzáadódott. A spontán SD a szöveti pH-t átlagban 6,93±0,09-ról átmenetileg 6,48±0,16-ra tolta el (5.4.4. ábra), mely fokális inzultus esetén inkább az iszkémiás mag régióra jellemző érték. Összehasonlításképpen, a nyúl agykéregben kialakított fokális iszkémia a szöveti pH-t 6,64-re csökkentette;²⁵⁸ patkány MCAO modellben az infarktus peremén a szöveti pH 6,53-nek adódott.¹⁹ Mindezeket figyelembe véve feltételezzük, hogy az SD az iszkémiás penumbrán végighaladva a szöveti pH-t átmenetileg az iszkémia mag régiójára jellemző, erősen savas tartományba tolja el, ami egy potens, neurodegenerációt eredményező kórfolyamat.

5.4.3. ábra. A nyers neutrálvörös (Neutral Red, NR) és lokális agyi vérátáramlás (cerebral blood flow, CBF) képsorok, azok egy meghatározott pontjából (region of interest, ROI) nyert intenzitásgörbék, és a beültetett elektródával elvezetett DC potenciál az iszkémia indukcióját és egy spontán terjedő depolarizáció (spreading depolarization, SD) áthaladását szemléltetik a látótéren. A: A reprezentatív felvételeken a szöveti acidózist az NR fluoreszcencia-intenzitásának emelkedése (melegebb színárnyalat) jelöli. A spontán SD belépését a látótérbe fehér nyíl (A4) szemlélteti. B: A lézer-folt interferencia kontraszt analízissel (laser speckle contrast analysis, LASCA) számított áramlási térképek az iszkémia indukciójával (kétoldali arteria carotis communis elzárás, two-vessel occlusion; 2VO) okozott áramlásesést, és az SD-vel járó CBF változást jelenítik meg. A sorozat képein a melegebb színek a magasabb áramlási viszonyoknak felelnek meg. A monokróm kamerák által készített 16 bites fekete-fehér felvételeket az A és B sorozaton szoftveresen pseudo-color alkalmazásával színeztük. A képsoroktól jobbra feltüntetett színskálák a színezéshez felhasznált szürke sávtartományt jelölik. C: Az idősorok az NR fluoreszcencia-intenzitásának (piros) és a CBF (fekete) iszkémiával és SD-vel összefüggő változásait mutatják. Az SD kialakulását a DC potenciál tranziens, negatív kitérése igazolta (zöld). Az NR intenzitásgörbék felett sorban lefelé mutató fekete háromszögek az A és B paneleken látható felvételpárok időbeli mintavételi helyét jelölik. A megjelenített változásokat a B1 felvételen megadott ROI, és az elektrofiziológiai változók elvezetésére beültetett mikroelektróda (E) segítségével jelenítettük meg.

A spontán SD után 10 perccel a szöveti pH savasabban maradt azokhoz a kísérletekhez képest, amelyekben az iszkémia előidézése után spontán SD nem jelentkezett (pH 7,09±0,09 vs.

7,29±0,16); utóbbi esetben 10 perc elteltével a szöveti pH az iszkémiát megelőző értékre tért vissza, azaz teljes mértékben rendeződött. Hosszú távon az SD után fennmaradó, enyhébb fokú acidózis is sejtkárosító lehet, hiszen az acidózis-indukálta sejtkárosodás küszöbe az acidózis fennállásának hosszával arányosan csökken.²⁷² Tekintve, hogy az iszkémiás kéregben az SD-k visszatérő mintázatban ismétlődnek,^184,270 és eredményeink szerint a szöveti pH az SD után legalább 10 percig savas tartományban marad, az SD a szöveti acidózis fenntartása révén is növelheti a neuronkárosodás kockázatát.

Az uralkodó hipotézis szerint az SD-okozta idegszöveti sérülés oka, hogy a csatolt CBF változásban a hipoperfúzió domináns szerephez jut, terjedő iszkémia alakul ki, amely mélyíti a szövetben fennálló perfúziós deficitet.^96,164 Azonban az iszkémiás penumbrán áthaladó SD-knek csak egy kis hányadához társul terjedő iszkémia. Az itt bemutatott kísérletek tanúsága szerint is az események többségét hiperémia kíséri. Eredményeink arra engednek következtetni, hogy bár az SD-vel járó hiperémia mértéke iszkémiás szövetben csökken, és valószínűleg nem elégíti ki teljes mértékben a szövet metabolikus igényeit, a szöveti pH csökkenése meghatározó módon járulhat hozzá az SD-vel kapcsolatos neurodegenerációhoz.

Ismert, hogy a szöveti acidózis az iszkémiás sérüléseket súlyosbítja, valamint hogy az iszkémiás idegsejt-károsodás mértéke a szöveti acidózissal arányos.³⁴⁵ A bemutatott kísérletek alapján megállapítható, hogy az SD az iszkémia során fellépő szöveti acidózist huzamos ideig fenntartja, átmeneti időszakokra jelentősen elmélyíti, és a szöveti pH rendeződését gátolja. Eredményeink alapján tehát azt feltételezzük, hogy az SD szövetkárosító hatása részben az acidózis révén érvényesül.

5.4.4. ábra. A szöveti acidózis időbeli mintázata az iszkémiával és a spontán megjelenő terjedő depolarizációval (spreading depolarization, SD). A: A vonaldiagramokat számos kísérletből származó felvételek átlagaként ábrázoltuk (átlag±stdev). A kísérleteket két csoporta osztottuk aszerint, hogy az iszkémia indukciója (kétoldali arteria carotis communis elzárás, two-vessel occlusion; 2VO) utáni percekben jelentkezett-e spontán SD () vagy sem (). B: A CBF legalacsonyabb értéke közvetlenül az iszkémia indukciója után. C: Az iszkémiával összefüggő szöveti acidózis relatív mértéke közvetlenül a spontán SD megjelenése előtt. A B-C paneleken az egyes kísérleteket egy-egy szimbólum jelzi. A vízszintes, szaggatott vonal a spontán SD kialakulásának elméleti küszöbértéket szemlélteti. D: A szöveti acidózis mértéke. A kék oszlop teljes kitöltéssel az SD-t közvetlenül megelőző pH értéket tünteti fel (2VO), a teljes, kiegészített oszlopmagasság az SD-okozta pH változást is hozzáadja. E: Szöveti pH 12 perccel az SD-t követően. . A D-E paneleken az adatokat átlag±stdev formában adtuk meg. A statisztikai értékeléshez egyszempontos variancia-analízist (ANOVA) használtunk (p<0,01** vs. iszkémia spontán SD nélkül).

Az eredmények újszerűsége, a kutatás távlatai

Kóros körülmények között először mutattuk meg és fejeztük ki az SD-hez társuló szöveti acidózis jellemzőit. Rávilágítottunk arra, hogy az SD-vel járó acidózis mértéke függ az idegszövet metabolikus állapotától, így iszkémia alatt a pH csökkenés jóval kifejezettebb, mint optimális szöveti perfúzió mellett. Bizonyítottuk, hogy az iszkémia okán fellépő, enyhébb acidózishoz hozzáadódik az SD-hez társuló, határozottabb pH csökkenés, mely arra enged következtetni, hogy az SD-okozta neuronpusztulás a szöveti acidózissal összefügg. Eredményeink abba az irányba mutatnak előre, hogy az extracelluláris tér pufferkapacitásának növelése vagy a laktát hatékonyabb eltávolítása eredményes neuroprotektív startégiának bizonyulhat.

Módszertani előrelépés, hogy a pH-alapú képalkotás révén térben is követni tudtuk az idegszövet SD-vel összefüggő pH változásait. A felvételek analízise során azonban még nem aknáztuk ki a módszerben rejlő összes lehetőséget. Az 5.2. fejezetben bemutatott, a CBF területi megoszlását jellemző teljes kép analízishez hasonlóan például jellemezni lehetne a feltárt agykérgi felszínen a szöveti pH változásának térbeli megoszlását is.

Eredményeink hasznosíthatósága szempontjából a következő megállapítás tehető. A klinikumban az SD-k neurodegenratív hatását az ismétlődő események elektrokortikogramon értékelhető kumulatív időtartamával hozzák összefüggésbe.^96,108 Megfigyeléseink szerint a szöveti pH SD-vel kapcsolatos változásai az iszkémiás sérülés érzékeny indikátorának tekinthetők. Ezek alapján az idegsebészeti intenzív osztályon alkalmazott laktát bioszenzor^181,288 alkalmas lehet a szöveti acidózis indirekt követésére, és az SD-okozta sérülés prognózisára.

Végül a szöveti pH csökkenése kihasználható a sérült területre korlátozódó gyógyszerhatóanyag-bejuttatásra iszkémiás sérülések esetén. Jelenleg futó kísérleteink azt vizsgálják, hogy savas pH-ra nyíló, az értágító nimodipint (L-típusú feszültség-függő Ca²⁺ csatorna blokkoló) szállító nanopartikulumok milyen hatékonysággal adják le a hatóanyagot és érnek el védő hatást az agyi iszkémia állatmodelljében. A szöveti pH alapján az iszkémiás szövetrégióra

leszűkített kezelések révén elkerülhetőek lennének a hatóanyagok nem kívánatos, szisztémás mellékhatásai.

A fejezethez vonatkozó eredeti közlemény:

Menyhárt Á, Zölei-Szénási D, Puskás T, Makra P, Orsolya MT, Szepes BÉ, Tóth R, Ivánkovits-Kiss O, Obrenovitch TP, Bari F, Farkas E.Spreading depolarization remarkably exacerbates ischemia-induced tissue acidosis in the young and aged rat brain.Sci Rep. 2017;7(1):1154.

6. Az agykérgi terjedő depolarizációhoz csatolt agyi vérátáramlási