In vitro csirke retina preparátum

Módszerek

A retina preparátumhoz hím házi csirkék (Isabrown, 7-28 napos, n=11) bal szemét használtuk, melyet cervikális diszlokáció és dekapitáció után távolítottunk el. A szemet az egyenlítői síkban átmetszettük, az üvegtestet váladékelszívóval eltávolítottuk, majd a hátsó féltekét szervkamrába helyeztük (4.1.1. ábra). A preparátumon Ringer oldatot áramoltattunk 1 ml/min áramlási sebességgel (az oldat összetétele: 100 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgSO4, 30 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, 1 mM CaCl2, 20 mM glükóz; 95 % O2 és 5 % CO2 gázelegyével buborékoltatva). A szervkamra hőmérsékletét folyamatosan monitoroztuk, és 32 ^oC-on tartottuk. Az SD-k kiváltására a retina pereméhez közel egy mikrodialízis pumpával (CMA/100, CMA/Microdialysis, Solna, Svédország) összekötött acél kanült helyeztünk el, melyből 15 percenként 1 l 0,1 M KCl oldatot fecskendeztünk lokálisan a szövet felszínére.

A helyi mezőpotenciál elvezetésére (LFP) a retina belső szinaptikus rétegébe (stratum plexiforme internum) üvegkapilláris elektródát szúrtunk (hegyének külső átmérője: 10 m).

Referenciaként a szervkamra aljába illesztett Ag/AgCl elektróda szolgált. A jelet felerősítettük, DC módban szűrtük (nagy impedanciájú előerősítő: NL 834, további szűrők és erősítők: NL 125, NL 106; Neurolog System, Digitimer Ltd., Welwyn Garden City, U.K.), és folyamatosan rögzítettük egy

analóg-digitális (A/D) átalakítóval (DASH16, Metrabyte, Keithley Instruments Ltd., Reading, U.K.) társított számítógépen. Az elektromos jelet egy ASYST programban írt alkalmazás segítségével képernyőn jelenítettük meg (MacMillan Software Co., Keithley Instruments Ltd., U.K.), és később ugyanezzel a programmal analizáltuk.

A kiváltott SD-k áthaladása a preparátumon a retinasejtek ozmotikus duzzadása révén szabad szemmel is követhető. A visszavert fény törését és intenzitásváltozását kihasználva így az SD-k optikai jelét is rögzítettük. A retinát optikai szál segítségével, hideg, fehér fénnyel világítottuk meg (fény-nyaláb beesési szöge 45^o a médium felszínéhez képest). A visszavert fényt (intrinsic optical signal, IOS) egy sztereomikroszkópra erősített (3,2 × nagyítás; MZ12.5, Leica Microsystems UK Ltd., Milton Keynes, U.K.) monokróm CCD kamerával rögzítettük (Qimaging, QICAM modell QIC-F-M-12; 12-bit digitális kimenet; Media Cybernetics UK, Marlow, U.K.). Számítógépes szoftver vezérlésével (ImagePro Plus; Media Cybernetics, U.K.), 2 Hz-es frekvenciával, 3 perc hosszú képsorokat vettünk fel 200 ms-os expozíciós idők mellett. A képsorok analízisét ugyanezzel a programmal végeztük. Minden esetben kijelöltünk a képsorokon egy érdeklődési területet (region of interest, ROI) (4.1.2. ábra) az SD terjedésével párhuzamosan, majd megadtuk a szürkeszint intenzitásának ROI-ra eső átlagát az idő függvényében.

4.1.1. ábra. Az in vitro csirke retina preparátum. A szemet egyenlítői síkban metszettük el (A), majd a hátsó féltekét szervkamrába helyeztük. A szervkamrát fehér fénnyel, vagy a feszültségfüggő festék (RH-1838) gerjesztő hullámhosszán (=625 nm) piros LED fényforrással világítottuk meg (B). A kiváltott terjedő depolarizáció (SD) áthaladása a preparátumon a feszültségfüggő festékkel feltöltött szöveten jól követhető (C1: RH-1838 inkubáció előtt; C2-C3: SD lefutásának megjelenítése RH-1838-al feltöltött szöveten). A C paneleken az SD-t kiváltó acél kanül a kép felső széléhez közel helyezkedik el; a képek bal alsó harmadában a madárszemre jellemző fésűszerv látszik.

Az SD-t jelölő mezőpotenciál-változások optikai megjelenítésére fluoreszcens, feszültségfüggő festéket használtunk (RH-1838, Optical Imaging Ltd., Rehovot, Izrael) (4.1.1. ábra). A festéket standard Ringer oldatban oldottuk; végső koncentrációját úgy határoztuk meg, hogy a 20 ×-osan hígított oldat optikai denzitása spektrofotométerrel mérve (Helios Gamma, Spectronic Analytical Instruments, Leeds, U.K.) 580 nm-es megvilágításnál 0,110 és 0,130 értékek közé essen. Az így elkészített RH-1838 oldatot -20 ^oC-on tároltuk, és maximum 5 kísérlethez használtuk ismételten.

A kísérletek megkezdésekor az RH-1838 oldatot a retina preparátumon 15 percig áramoltattuk 1 ml/perc sebességgel. Az első SD kiváltását megelőzően újabb 15 percig Ringer oldatos átmosással távolítottuk el a festékfelesleget. Az egyes SD-k kiváltása során a szövetben felhalmozódott RH-1838-at piros LED fényforrással folyamatosan gerjesztettük (csúcs-hullámhossz: 625 nm; SLS-0307-A, számítógép-vezérelt tápegység: Sirius LED vezérlő SLC-SA04-U;

Mightex, Pleasanton, CA, U.S.A.). A kibocsátott fluoreszcenciát egy sztereomikroszkópra erősített (4 × nagyítás; MZ12.5, Leica Microsystems UK Ltd., Milton Keynes, U.K.), felüláteresztő szűrővel ellátott (>670 nm; 695AF55, Omega Optical, Brattleboro, VT. U.S.A.), monokróm CCD kamerával rögzítettük (Pantera 1M30, Dalsa, Gröbenzell, Németország). Számítógépes szoftver vezérlésével (ImagePro Plus; Media Cybernetics, U.K.), 2 Hz-es frekvenciával, 3 perc hosszú képsorokat vettünk fel 500 ms-os expozíciós idők mellett. A fluoreszcencia-intenzitás SD-vel összefüggő időbeli

változásait az IOS analízishez hasonlóan értékeltük és ábrázoltuk, majd az RH-1838 a felvételi idő alatt lineárisnak mért fakulására korrigáltuk.

Annak érdekében, hogy a különböző elektromos és optikai jelek változásainak mértékét egymással összevethessük, a jeleket végül az alapra (0 %) és a maximum kitérésre (100 %) vonatkoztatott relatív formában is kifejeztük. Az egyes kísérletekből így kapott idősorokat végül a depolarizáció inflexiós pontját figyelembe véve egymásra illesztettük, átlagoltuk, és átlag±stdev formában ábrázoltuk.

Eredmények, és azok értelmezése

Korábbi közleményekkel összhangban,^77,247 a retinán terjedő SD-t a DC potenciál tranziens, negatív kitérése (amplitúdó: -17,9±2,3 mV, n=6) és az IOS tranziens emelkedése jellemezte (amplitúdó: 366,7±80,4 szürkeszint változás, azaz a QICAM kamera 0-4095 terjedelmű szürkeskálája alapján 9,0 % emelkedés; n=6) (4.1.2. ábra). Az IOS SD-vel összefüggő változása annyira jelentősnek bizonyult, hogy az SD áthaladása a retina preparátumon szabad szemmel is láthatóvá vált. Az egyes kísérletekben ismételten kiváltott SD-k a DC potenciál és az IOS tekintetében egymáshoz nagyon hasonló kinetikát mutattak, így a jelenség kísérletesen jól reprodukálhatónak bizonyult. Az RH-1838-al feltöltött szöveten az SD-ket a feszültségfüggő festék fluoreszcencia-intenzitásának tranziens emelkedése kísérte (amplitúdó: 99,5±31,8 szürkeszint változás, azaz a DALSA kamera 0-4095 terjedelmű szürkeskálája alapján 2,4 % emelkedés; n=5) (4.1.1. ábra, C2-3 panel). Az egyes kísérletekben ismételten kiváltott SD-k RH-1838 alapú fluoreszcens jelintenzitás-változása is jól reprodukálható volt, kivéve a jel SD-vel összefüggő maximális kitérését, mely az egymást követő SD-k során fokozatosan csökkent. Ennek oka a fluoreszcens festék fakulásával magyarázható. Az adott kísérleti elrendezésben (azaz 625 nm hullámhosszcsúcsú megvilágítás és 670 nm felett szűrt fénykibocsátás mellett) RH-1838 elhagyásával optikai jelet nem tudtunk rögzíteni. Ez a megfigyelés igazolta, hogy az RH-1838 alapú optikai jelet nem szennyezte egyéb, endogén eredetű fluoreszcencia.

Ahhoz, hogy az RH-1838 SD-vel kapcsolatos fluoreszcencia-intenzitásbeli változásait potenciálváltozásnak feleltethessük meg, a DC potenciállal hasonlóságot, az IOS-től pedig eltérést vártunk. Megfigyeltük, hogy bár a depolarizáció fázisa a három szignál esetén tökéletes egyezést mutatott, a repolarizáció fázisa, illetve az alapvonalra történő visszatérés a három jelre nézve eltérően alakult (4.1.2. ábra). Az RH-1838-al megjelenített repolarizáció sebessége a DC potenciál visszatérésével egybeesett; ugyanakkor az RH-1838 fluoreszcenciája egy SD-t követő, jól látható hiperpolarizációt is jelölt. A hiperpolarizáció fázisa a DC potenciál illetve az IOS esetén nem mutatkozott. Az IOS kinetikája jelentősen eltért a DC potenciáltól és az RH-1838-alapú jeltől, mivel az IOS alapján a repolarizáció késleltetve alakult ki, illetve a felvett 3 perces időablakban nem állapodott meg az SD előtti alapvonalon (4.1.2. ábra).

4.1.2. ábra. A feszültségfüggő festék (RH-1838) fluoreszcenciájának intenzitásváltozása az idő függvényében, az in vitro csirke retina preparátumon átvonuló terjedő depolarizáció (SD) alatt. Az RH-1838 jelintenzitás-változását összevetettük a DC potenciál (A) és a visszavert fényintenzitás (intrinsic optical signal, IOS) változásival (B). Az egyes vonaldiagrammokat számos SD átlagolásával kaptuk (RH-1838: n=5; DC potenciál: n=6; IOS: n=6), és átlag±stdev formában adtuk meg. A DC potenciál SD-t jelölő tranziens, negatív kitérését felfelé ábrázoltuk, hogy az optikai jelekkel egyirányba mutasson, és azokkal közvetlenül összehasonlítható legyen. A felvétel (B) hűen tükrözi az RH-1838 fluoreszcenciájának intenzitás-változását az SD-vel.

Az eredmények alapján megállapítható, hogy az RH-1838 fluoreszcenciájának intenzitásváltozása az SD DC módban elvezetett elektrofiziológiai jellemzőivel erős megegyezést mutatott, így az RH-1838 alapú optikai jel a szöveti potenciálváltozásoknak megfeleltethető. A hiperpolarizáció fázisára vonatkozó eltérés oka lehet, hogy az optikai jel és a DC potenciál keletkezése eltér; míg az elektróda pozíciójánál fogva a retina belső szinaptikus rétegéből regisztrált, az RH-1838 festéket feltehetően a retina minden sejttípusa és rétege felvette. Az is valószínűsíthető, hogy az RH-1838 gerjesztésére használt fény elsősorban a retina felszíni rétegeibe jutott be, így az emisszió döntően itt keletkezhetett.

Összefoglalva, az RH-1838 feszültségfüggő festék in vitro körülmények között alkalmasnak bizonyult az SD-re jellemző mezőpotenciál-változások képi megjelenítésére. A kapott eredmények alapján a képalkotó módszert a továbbiakban altatott patkányon készített agykérgi preparátumra adaptáltuk.