Magyarország különbözõ borvidékeirõl származó filoxéra populációk szaporodási sajátosságainak, populációdinamikai különbségeinek a megfigyelését laboratóriumi gyökértesztben és tenyészedényes kísérletben vizsgáltuk meg. A különbségek DNS szintû igazolását genetikai módszerrel végeztük.
A laborvizsgálatot Keszthelyen a Veszprémi Egyetem Georgikon Mezõgazdaságtudományi Kar, Kertészeti Tanszékén; a tenyészedényes kísérletet a Tanszék üvegházában és a genetikai vizsgálatot a Veszprémi Egyetem Georgikon Mezõgazdaságtudományi Kar, Növénynemesítési és Biotechnológiai Tanszék laboratóriumában végeztük.
A vizsgálatokat 2001. szeptemberében indítottuk és az eredmények kiértékelését 2005-ben fejeztük be.
4. 1. LABORATÓRIUMI GYÖKÉRTESZT ANYAGA ÉS MÓDSZERE 4. 1. 1. Laboratóriumi gyökérteszt anyaga
A laboratóriumi gyökérteszt vizsgálati anyagát szõlõfajták (Vitis vinifera cv.
Chardonnay- továbbiakban Chardonnay, Vitis berlandieri x Vitis riparia Teleki 5C-továbbiakban Teleki 5C, Vitis berlandieri x Vitis riparia T.K.5BB x Vitis vinifera Georgikon 28 - továbbiakban Georgikon 28) illetve azok gyökerei képezték. A nevezett vizsgálati anyagot 10 magyar borvidékrõl származó filoxéra levéllakó alakjának tojásaival mesterségesen fertõztük.
A laboratóriumi gyökértesztben felhasznált szõlõfajták és jellemzésük
• Vitis viniferacv. Chardonnay
Chardonnay korán fakadó, virágzó és zsendülõ fajta. Közepes termõképességû, kiváló minõséget adó fajták közé tartozik. Fagytûrése jó, fekvés és talaj iránt mérsékelten igényes, viszonylag szárazságtûrõ. Saját gyökéren filoxérára érzékeny (CSEPREGI és ZILAI, 1988).
.
• Vitis berlandieri x Vitis ripariaT.K. 5BBx Vitis viniferaGeorgikon 28
Georgikon 28 hajtásai gyorsan fejlõdnek és hosszúra nõnek, sok hajtást nevel és azokat majdnem minden évben teljes hosszúságban beérleli. Hajtásai a Teleki 5C-vel azonos idõben érnek. A filoxéra levéllakó alakjával szembeni ellenálló képessége jó (BAKONYI és KOCSIS, 2004).
• Vitis berlandieri x V. ripariaTeleki 5C
Hajtásai gyorsan fejlõdnek és hosszúra nõnek, sok hajtást nevel és azokat teljes hosszúságban beérleli. Hajtásai a Teleki hibridek közül a legkorábban érnek. A filoxéra levéllakó alakjával szembeni ellenálló képessége jobb, mint az 5BB-nek (CSEPREGI és ZILAI, 1988).
Filoxéra populációk származási helyei
Filoxéra populációkat a laboratóriumi gyökérteszthez Magyarország 10 különbözõ borvidékérõl gyûjtöttük be, melyek az alábbiak voltak (17.ábra):
Balaton melléke borvidék (Keszthely) Balatonfüredi-Csopaki borvidék (Csopak) Balatonboglári borvidék (Dél-Balaton) Badacsonyi borvidék (Badacsony) Villányi borvidék (Villány)
Pécsi borvidék (Pécs)
Csongrádi borvidék (Csongrád) Tokaji borvidék (Tokaj)
Pannonhalmi borvidék (Mosonmagyaróvár) Egri borvidék (Eger)
Filoxéra populációk származási helyei:
Laboratóriumi gyökérteszt Tenyészedényes
kísérlet Genetikai
vizsgálat
17. ábra. Magyarország borvidékei (HNT honlapja)1
1Jelmagyarázat:
1. Ászár-Neszmélyi borvidék (1) 2. Balatonboglári borvidék (7)
3. Balatonfüredi-Csopaki borvidék (3) 4. Balaton melléke borvidék (22) 5. Balatonfelvidéki borvidék (4) 6. Badacsonyi borvidék (2) 7. Bükkaljai borvidék (5) 8. Csongrádi borvidék (6) 9. Egri borvidék (5)
10. Etyek-Budai borvidék (9) 11. Hajós-Bajai borvidék (10) 12. Kunsági borvidék (11) 13. Mátrai borvidék (12) 14. Pécsi borvidék (13) 15. Móri borvidék (14)
16. Pannonhalmi borvidék (15) 17. Somlói borvidék (16) 18. Soproni borvidék (17) 19. Szekszárdi borvidék (18) 20. Tokaji borvidék (19) 21. Tolnai borvidék (20) 22. Villány borvidék (21)
4. 1. 2. Laboratóriumi gyökérteszt módszere
Mesterséges fertõzés módszereivel többen is foglalkoztak, melynek során a szõlõ levelét vagy a gyökerét fertõzték meg. A vizsgálatunkat DE BENEDICTIS és GRANETT (1992) útmutatásai alapján végeztük, a levélgubacsból kivett filoxéra tojásokat a gyökérre helyeztük.
A vizsgálathoz a gyökereket a Veszprémi Egyetem Georgikon Mezõgazdaságtudományi Kar cserszegtomaji telepérõl és Kertészeti Tanszékének üvegházi növényeirõl gyûjtöttük be. A vizsgálathoz 90 mm átmérõjû mûanyag Petri-csészéket használtunk. A Petri-csészékben elhelyezett gyökereket 46 napig szobahõmérsékleten, a természetes körülményekhez hasonlóan fénytõl elzárt helyen tároltuk.
A kísérlethez a gyökereket a következõk szerint készítettük elõ. Folyó csapvízben mostuk, majd desztillált vízzel öblítettük le a gyökereket. Majd a ezeket 70-80 mm-es részekre daraboltuk és a gyökerek egyik végét ferdén lemetszettük. Egy Petri-csészébe 3 gyökeret helyeztünk el, melyek ferdén lemetszett végére desztillált vízbe mártott háztartási vattát tekertünk. Egy gyökérre 10, levélgubacsból kiszedett filoxéra tojást raktunk. A kezelések 3 ismétlésben történtek (18. ábra). A tíz tojással megfertõzött, egy Petri-csészében elhelyezett, azonos fajtájú 3 gyökér egyenkénti vizsgálata adta az ismétléseket.
18. ábra. Gyökértesztre elõkészített szõlõgyökerek (Keszthely, 2003) (Fotó: L. Tóth)
Gyökerenként elkülönítve számoltuk meg a fejlõdési alakokat (nimfa, kifejlett egyedek-nõstények, tojások). Vizsgálatokat mikroszkóp segítségével 16x-os nagyításnál végeztük. Az értékelés a 2003-as évben a fertõzést követõ 12., 18., 25., 32., 39. és 46.
napon történt.
4. 2. TENYÉSZEDÉNYES KÍSÉRLET ANYAGA ÉS MÓDSZERE
4. 2. 1. Tenyészedényes kísérlet anyaga
A tenyészedényes kísérletben Magyarország 20 különbözõ szõlõtermesztõ helyérõl (18 magyar borvidékrõl) származó (17. ábra) filoxéra levéllakó alakjának tojásait helyeztünk tenyészedényben nevelt Vitis vinifera cv. Chardonnay - továbbiakban Chardonnay - dugvány, Vitis berlandieri x Vitis riparia Teleki 5C oltott Chardonnay -továbbiakban Teleki 5C alanyra oltott Chardonnay - oltvány gyökérzónájába.
A tenyészedényes kísérletben felhasznált szõlõfajták és jellemzésük
A kísérlet növényi anyagát (Chardonnay, Teleki 5C) már ismertettük (4. 1.
fejezet).
Filoxéra populációk származási helyei
Magyarország 20 különbözõ szõlõtermesztõ helyérõl (18 borvidékrõl, 17. ábra) begyûjtött filoxéra populációk fejlõdését vizsgáltuk meg tenyészedényes kísérletben.
A tenyészedényes kísérletben felhasznált filoxéra populációk a következõk voltak: ’Sopron’ (Soproni borvidék), ’Zalaegerszeg’ (Balaton melléke borvidék),
’Badacsony’ (Badacsonyi borvidék), ’Cegléd’ (Kunsági borvidék), ’Bogács’ (Bükkaljai borvidék), ’Markaz’ (Mátrai borvidék), ’Kiskassa’ (Pécsi borvidék), ’Balatonkeresztúr’
(Balatonboglári borvidék), ’Szekszárd’ (Szekszárdi borvidék), ’Eger’ (Egri borvidék),
’Tokaj’ (Tokaji borvidék), ’Simontornya’ (Tolnai borvidék), ’Mór’ (Móri borvidék),
’Cserszegtomaj’ (Balatonfelvidéki borvidék), ’Dunaalmás’ (Ászár-Neszmélyi borvidék),
’Pázmánd’ (Etyek-Budai borvidék), ’Balatonfüred’ (Balatonfüred-Csopaki borvidék),
’Ság-hegy’ (Somlói borvidék), ’Öregbaglas’ (Balatonboglári borvidék), ’Pécsvárad’
(Pécsi borvidék).
4. 2. 2. Tenyészedényes kísérlet módszere
A vizsgálathoz 220, 5 literes tenyészedényt használtunk. 2002 áprilisának elsõ hetében 110 Teleki 5C alanyra oltott Chardonnay növényt és 110 saját gyökerû Chardonnay növényt sterilezett homok és tõzeg ²/3:¹/3 arányú keverékébe ültettünk el.
Ezekbõl 10-10 növényt kontrollnak állítottunk be. A nyár folyamán 20 különbözõ termõhelyrõl gubacsos leveleket gyûjtöttünk be. A levélgubacsok borotvapengével történõ feltárása során 200 filoxéra tojást vettünk ki, amit rátettünk desztillált vizes itatóspapírra és óvatosan ráhelyeztük a fertõzni kívánt gyökérre.
A kísérletben (200 tojás x 5 növény x 20 filoxéra populáció x 2 fajta) összesen 40.000 filoxéra tojást használtunk fel. A vizsgálatokhoz szükséges filoxéra populációkat különbözõ szõlõfajtákról és különbözõ termõhelyekrõl gyûjtöttük be, így a levelek minõsége illetve az azokon lévõ levélgubacsok mennyisége is változó volt. A gubacsok feltárása során egyes gubacsokban csak kb. 20 tojás volt. Az alanyfajtákról begyûjtött gubacsos leveleknél viszont elõfordult, hogy egy gubacsban 1-3 szûznemzõ nõstény 200-350 tojást hozott létre. Így a 200 tojást a kevesebb tojást tartalmazó gubacsoknál 8-10 gubacsból, az alanyfajtáknál pedig egy gubacsból szedtük ki.
A növények mesterséges fertõzését 2002. júliusában kezdtük. A tesztnövényeket az elültetés után 9 alkalommal permeteztük a kórokozók (lisztharmat, peronoszpóra) és kártevõ (levélatka) kártételének mérséklése érdekében. A kísérleti növényeket egyedileg öntöztük és a nedvesség felfogására a növények tenyészedényei alá alátéteket helyeztünk. Télen növényenként kéthetente 100 ml-t, nyáron heti két-három alkalommal 150 ml vizet juttatunk ki. A növényeket 4 havonta tápoldattal (Substral) kezeltük. A 2002-es és a 2003-as év is melegnek mutatkozott, ezért a perzselés elkerülése végett az üvegház külsõ felületét lemeszeltük és rasel hálót húztunk ki a növények feletti térben. A víz párolgását a tenyészedényekre kifeszített alufóliával próbáltuk mérsékelni (19. ábra).
A kísérlet kiértékelése két vegetációs periódus után 2003. szeptemberében történt. A vizsgált növényeknél a hajtásérés már júliusban megindult, majd utána elkezdõdött a lombszínezõdés is. A felvételezést a hajtások beérésének megindulása után és még a lombhullás elõtt hajtottuk végre.
19. ábra. Tenyészedényes kísérlet (Keszthely, 2003) (Fotó: L. Tóth) Felvett adatok:
• vékony gyökerek mennyisége
• vékony gyökerek hossza
• vastag gyökerek mennyisége
• vastag gyökerek hossza
• levelek mennyisége
• internódiumok mennyisége
• internódiumok hossza
• nedves gyökértömeg
• nedves hajtástömeg
• száraz gyökértömeg
• száraz hajtástömeg
• nodozitások mennyisége
• tuberozitások mennyisége
A felvett adatoknál a vastagabb gyökér alatt a ceruza vastagságot megközelítõ 6-7 mm átmérõjû, elparásodott bõrszövettel rendelkezõ gyökereket értjük. Az ennél vékonyabb, elparásodott bõrszövettel nem rendelkezõ gyökerek a vékony gyökerek.
A felvett növényi életképességet meghatározó tulajdonságok közül a vastag gyökerek hosszát, a levelek mennyiségét, internódiumok hosszát, a nedves gyökértömeget, a nedves hajtástömeget, a száraz gyökér- és hajtástömeget, nodozitások mennyiségét és a tuberozitások mennyiségét vizsgáljuk, mert a korábbi kutatások szerint a filoxéra kártétele ezekre a tulajdonságokra van hatással.
4. 3. GENETIKAI VIZSGÁLAT ANYAGA ÉS MÓDSZERE
4. 3. 1. Genetikai vizsgálat anyaga
A genetikai vizsgálathoz szükséges filoxéra populációkat 34 településrõl gyûjtöttük. A begyûjtött gubacsos leveleket a felhasználásig hûtõszekrényben tároltuk. A levélmintákat károsodás nélkül 2-3 hétig tudtuk így eltartani.
A 15 településrõl származó 23 minta Badacsony, Balatonfenyves, Balatonkeresztúr, Becsehely, Beled, Cegléd, Cserszegtomaj, Lövõ, Nagykanizsa, Öregbaglas, Pölöske, Ság-hegy, Simontornya, Zalaapáti, Zalaegerszeg települések szõlõültetvényeirõl származtak (17. ábra). Egy gyûjtési helyrõl egyszeri alkalommal 6 mintát vontunk be a vizsgálatba, melyet a vizsgálat során négyszer-hatszor ismételtünk.
Így egy populációnál 24-36 minta elemzése fordult elõ. A 3 év alatt megközelítõen 600 hazai filoxéra mintát vizsgáltunk meg, melyek közül az említett 15 település mintáit választottuk ki (26. ábra, 27. ábra).
4. 3. 2. Genetikai vizsgálat módszere
A genetikai vizsgálatok rövid leírása után a módszert részletesen is bemutatjuk.
A filoxéra DNS-ének kinyerése Astrid Forneck (2000) módszere alapján a VE GMK Növénynemesítési és Biotechnológiai laboratóriumában történt. Az allélpolimorfizmus kimutatását RAPD (random amplified polymorphic DNA) módszerrel hajtottuk végre. A szõlõ-gyökértetû DNS-szintû elemzését külföldi kutatásokban is két módszerrel a RAPD és az AFLP módszerrel végzik, melybõl a RAPD módszer pontosabb eredményt ad a filoxéra minták közötti különbségek kimutatására, ezért mi is ezt használtuk.
A polimorfizmust a gélelektroforézissel elválasztott DNS fragmentumok eltérõ mérete és száma adja. A láncreakcióhoz 2 újonnan kifejlesztett hazai primert alkalmaztunk. A PCR terméket 1, 5 %-os agaróz gélben méretük szerint elektroforézissel szétválasztottuk, majd etídium-bromidos festéssel a mintázatot láthatóvá tettük.
A hagyományos RAPD módszer során 10 nukleotidból álló primert használnak, mi 2 darab 12 nukleotidból álló primert használtunk. Így az általunk alkalmazott módszer több termék kimutatását teszi lehetõvé, mint a hagyományos módszer.
Azért választottuk ezeket a primereket, mert más élõlényeknél használva (hal, burgonya, paprika, parlagfû) lényegesen több terméket produkáltak, mint a hagyományos RAPD. A genetikai vizsgálat során nem csak ezzel a két primerrel dolgoztunk. Az elsõ évben többet kipróbáltunk a 100 tervezett primerbõl, mely során a 2-es és a 49-es számú primerek használatával kaptuk a legjobb eredményeket, így a további vizsgálatokban már csak ezeket használtuk.
Külföldi irodalomban már használt kontroll primert nem használtunk. Úgy terveztük, hogy a kísérletben alkalmazott primerpár specifikusságát a külföldi és a hazai minták RAPD elemzése során hasonlítjuk össze. A jelen vizsgálat azonban csak reprezentatív jellegû, a laboratóriumi és a tenyészedényes kísérlet eredményeit hivatott kiegészíteni.
A.) DNS tisztítás lépései
A DNS tisztítást FORNECK (2002) által leírtak szerint végeztük el. A levélbõl kivett filoxéra szûznemzõ nõstényt 1, 5 ml-es mikrocentrifugacsõben szétdörzsöltük. A csõbe 3 x 30 µl puffert adagoltunk és a filoxérát dörzslándzsával összezúztuk, majd felrázattuk (vortexeltük) az anyagot. A fehérjéket vízfürdõben 40 percig 65 °C-on történõ inkubálással denaturáltuk. Ezután 100 µl kloroform-izoamil alkoholt (24:1) adtunk hozzá és pár percig forgattuk a csöveket. Majd 6 percig 10.000 rpm fordulatszámon centrifugáltuk a folyadékot. A felsõ réteget egy tiszta mikrocentrifugacsõbe pipettáztuk át, a denaturált fehérjék a szerves és vizes fázis találkozásánál maradtak. Az elegyhez 10 µl Nátrium-acetátot és etanolból az anyag mennyiségének a kétszeresét adtuk hozzá. Rázatás után a mintákat fél órára mélyhûtõbe tettük, majd 15 percig 14.000 rpm fordulatszámon centrifugáltuk a folyadékot. A mintákat 70%-os alkoholos mosás után kiszárítottuk. A száraz anyagot 40 µl LTE (10%-os TE) pufferben oldottuk fel.
B.) Polimeráz láncreakcióhoz (PCR = Polymerase Chain Reaction) való elõkészítés:
Jégágyon készítettük el a PCR keveréket. DNS- extraktum 4 µl-jéhez 10, 8 µl IEW, 2 µl 10x PCR Puffer, 2 µl dNTP (dezoxi-nukleozid-trifoszfát), 2 µl primer1 (10 pM), 2 µl primer 2 (10 pM), 0, 8 unit DNS- polimeráz elegyét adtuk.
A módszer a DNS egy specifikus részének a felszaporítását teszi lehetõvé. A polimeráz láncreakció (PCR) PCR Robocycler (Stratagene, USA) készülékben zajlott le.
A módszer a DNS specifikus szekvenciáinak enzimatikus szintézisére szolgál. A primerek (2., 49.) szekvenciái a következõk voltak: ACGATGAGCCTG-3’, 5’-GGCGCGTTAGAG-3’.
A módszer lényege az, hogy a két oligonukleotid hibridizál a templát DNS szemközti szálához. A reakció ismétlõdõ ciklusok sorozatából áll, melyek a következõk:
a minta denaturálódása, primer hibridizálása, primer kiterjesztése a DNS polimeráz enzim segítségével. A reakciónál a kettõs szálú DNS-t 94 °C-on denaturáltuk. A reakció elegyet lehûtöttük 37 °C-ra, hogy az oligonukleotidok hibridizáljanak a DNS kiegészítõ szakaszaihoz. A reakcióelegyet ezután felmelegítettük 72 °C-ra és ekkor az egyszálas minta alapján megtörténik a kettõ szál szintézise. A fenti ciklust 35-ször ismételtük meg.
C.) PCR termékek detektálása:
A kapott PCR termék egy részét 4µl Bróm-fenolkék és Xylen-cyanol festék elegyével kevertük és a megöntött 1,5%-os agaróz gél zsebeibe töltöttük. 220 V-on a részeket méretük szerint szétválasztottuk. A futtatás után a gélt 20 percig etídium -bromidos folyadékba helyeztük. A detektálást Genegenius géldokumentációs (Syngene, UK) rendszerrel történt és a gélképet lefényképeztük.