Versengő immunszenzor zearalenon kimutatására

Zearalenon detektálására alkalmas indirekt immunszenzort alakítottunk ki mind az aminocsoportokat hordozó felületen, mind pedig a karboxilcsoportokat tartalmazó szenzorok felhasználásával.

5.4.2.4.1. Immunszenzor kialakítása aminofunkcionalizált szenzorfelületen

A mérési módszer optimalizálása során a szenzorfelületen rögzített zearalenon-BSA-konjugátum koncentrációját, valamint az alkalmazott poliklonális szérum hígításának mértékét vizsgáltuk. A szenzor felületén 2, 5, 10 és 20 µg/ml ZON-BSA-konjugátumot rögzítettünk 2,5%-os glutáraldehidoldattal (5.22. ábra).

68

5.22. ábra A rögzített ZON-BSA koncentrációjának hatása az indirekt immunszenzor működésére (2000x hígított szérum)

Összehasonlítva a különböző koncentrációjú ZON-konjugátummal érzékenyített szenzor szérumokra adott válaszait, megállapítottuk, hogy a legnagyobb szenzorválaszokat és a legstabilabb jeleket is 10 µg/ml zearalenon-BSA-konjugátum rögzítése során kaptuk (10^-2 pg/ml standardra 8,13±1,24 egység, míg 10^-1 pg/ml standardra 18,77±2,62 egység), ezért a továbbiakban ezt a konjugátomkoncentrációt alkalmaztuk.

5.23. ábra Szenzorjelek a szérumhígítás függvényében (10 µg/ml ZON-BSA rögzítve)

A szérumok vizsgálata során különböző hígításban (16000x, 8000x, 4000x, 2000x, 1000x, 500x) injektáltuk a mintákat a 10 µg/ml ZON-BSA-val érzékenyített szenzorra. Az eredmények alapján (5.23. ábra) látható, hogy a nagy hígítású (16000x, 8000x) szérumok válaszai közel azonosak, esetükben nem kaptunk megfelelő válaszgörbét. Az 1000x, valamint az 500x hígítású szérumok által adott válaszok elválnak a többi görbétől, túl nagy jelet adnak. A 2000-4000x hígítással jól definiálható,

69

szép görbéket mértünk. Ezt követően a fenti paraméterek alkalmazásával immunszenzort készítettünk a felületen 10 µg/ml ZON-BSA-konjugátumot glutáraldehiddel kovalensen rögzítve. A 2000x hígítású szérummal felvett kalibrációs görbe érzékeny szakasza a 10^-2-10¹ pg/ml ZON-koncentráció között volt, a detektálás alsó határa 5x10^-3 pg/ml ZON.

5.4.2.4.2. Immunszenzor kialakítása karboxilált szenzorfelületen

A karboxilcsoportokat tartalmazó szenzoron korábban (ld. 5.3.2. és 5.4.1.4.2.

fejezet) ismertetett rögzítési eljárás és az optimálisnak talált paraméterek alkalmazásával felvettük a zearalenon kalibrációs görbéjét. A rögzítéshez 10 µg/ml ZON-BSA-konjugátumot alkalmaztunk. A versengő immunszenzor kalibrációs görbe dinamikus szakasza ebben az esetben 10^-2-10² pg/ml értékek közé esett, a detektálás alsó határa 2x10^-3 pg/ml ZON.

Összevetve az amino-, illetve a karboxifunkcionalizált felületeken kapott szenzorválaszokat, elmondható, hogy mindkét rögzítési eljárással hasonló detektálási határt és dinamikus méréstartományt értünk el, azonban az aminocsoportokat hordozó felületek esetében a görbék nagyobbak, a jel csökkenése, a gátlás mértéke is nagyobb, mint a karboxifelületek alkalmazásánál, ugyanakkor a karboxifelületek a korábbi mérésekhez hasonlóan stabilabb, reprodukálhatóbb válaszokat adtak.

5.4.2.4.3. Zearalenonspecifikus szenzor szelektivitásának vizsgálata

Vizsgáltuk, hogy a különböző zearalenonszármazékok, a különböző szintetikus közti termékek mekkora keresztreakciót adnak a kifejlesztett szenzorral. A zearalenonra kapott szenzorválaszt 100%-nak véve vizsgáltuk, hogy azonos koncentrációban a különböző származékok mekkora jelet adnak a zearalenon jeléhez képest. Az 5.5.

táblázat alapján megállapítottuk, hogy a zearalenon szelektíven meghatározható a vizsgált származékok között, az OWLS detektáláson alapuló immunszenzorral mért eredmények, valamint az ELISA referencia módszerrel mérhető adatok között nincs szignifikáns különbség, a két módszer szelektivitása közel azonos.

Vegyület CR OWLS szenzorral (%)

CR ELISA módszerrel (%)

zearalenon 100 100

α-zearalenol 25,2 28,2

α-zearalanol 12,8 7,1

β-zearalanol 2,7 1,1

5.5. táblázat Különböző vegyületek keresztreakciójának nagysága (CR) versengő immunszenzorral és ELISA módszerrel

5.4.2.4.4. A kifejlesztett zearalenon szenzor alkalmazása kukorica minták mérése Kukorica-vetőmagőrleményből készített, mesterségesen szennyezett (spike) mintákkal vizsgáltuk a ZON-szelektív immunszenzor alkalmasságát a minták elemzésére, az eredményeket az ELISA referencia módszerrel hasonlítottuk össze.

70

1.E-05 1.E-03 1.E-01 1.E+01 1.E+03 zearalenon koncentráció (pg/ml)

1.E-05 1.E-03 1.E-01 1.E+01 1.E+03 zearalenon koncentráció (pg/ml)

tömeg/felület(egység)

100x 1000x 10000x

5.24. ábra Különböző hígítású kukoricaminták zearalenontartalmának kalibrációs görbéje (10 µg/ml ZON-BSA rögzítve, 2000x hígított szérum)

A mesterségesen szennyezett mintákból a 4.3.2. fejezetben leírtak szerint készített acetonitril–víz-kivonatot készítettünk, majd a mintákat tovább hígítottuk TRIS pufferrel (42 mmol/l, pH 7,4), és vizsgáltuk, hogy milyen hígításban tudjuk megfelelő érzékenységgel mérni a zearalenon koncentrációját. A vizsgálat során tanulmányoztuk, hogy miként befolyásolja a kimutatást a minta mátrixhatása, másrészt pedig ellenőriztük, hogy a két analitikai módszer – kimutatási koncentrációtartományukon belül – azonos, s a bevitt névleges zearalenonkoncentrációnak megfelelő koncentrációt mutat-e. Az 5.24. ábrán bemutatott eredmények szerint a mintákat 100x, 1000x, illetve 10000x hígítva csökkent a minták mátrixhatása, és ennek következtében nőtt a jelek közötti különbség, bár a hígabb minták esetében kisebb koncentrációban volt a zearalenon jelen.

A mesterségesen szennyezett kukoricamintákból egy sorozatot a kalibrációs görbe felvételéhez használtuk, míg a további mintákat ismeretlenként vizsgáltuk, és meghatároztuk a ZON visszanyerésének százalékát, az eredményeket az 5.6. táblázatban foglaltuk össze. A minta-előkészítés során a visszanyerés minden minta esetén meghaladta a 70%-ot, bizonyítva, hogy az eljárás megfelelő a kukoricaminták vizsgálatához, a minták zavaró mátrixhatását a minták 10000x hígításával sikeresen csökkentettük.

A kukoricaminták OWLS szenzorral mért gátlási középérték (IC50) 0,05 pg/ml volt, míg az ELISA mérésnél ez az érték 2,04±0,66 ng/ml-nek adódott. Az ELISA vizsgálatok tapasztalatai szerint kukoricamintákból az acetonitriles extraktumot 1:10 hígításban alkalmazva a zearalenont 0,1 ng/ml koncentráció felett tudtuk kimutatni.

Az 5.6. táblázatban az ismeretlenként kezelt minták OWLS technikával és ELISA módszerrel mért eredményeit hasonlítottuk össze. A mérési eredmények összevetéséből megállapíthatjuk, hogy a két módszer jól megfelel egymásnak, mindkét eljárás alkalmas a kukoricaminták zearalenontartalmának meghatározására a jelenleg megengedett határértékeknek megfelelően, azonban az OWLS szenzorral kb. 1,5 nagyságrenddel kisebb zearalenon kimutatására is lehetőség van.

71

5.6. táblázat Kukoricaőrleményhez adott (spike) zearalenon visszanyerésének meghatározása, OWLS és ELISA módszerrel mért koncentrációk összehasonlítása (független kétmintás t-próba alapján P<0,05 szignifikanciaszinten az eredmények között

nincs szignifikáns különbség)

Összefoglalásként elmondható, hogy sikeresen fejlesztettük ki jelölésmentes versengő immunszenzort zearalenon meghatározására. A zearalenonból haptént, majd BSA és ConA fehérjékhez kötve konjugátumokat készítettünk. A ConA-t tartalmazó konjugátummal antitestet termeltettünk, majd a megfelelően tisztított biomolekulákkal immunszenzort alakítottunk ki. Az aminocsoportokat hordozó felületen készített szenzorral 10^-2-10¹ pg/ml ZON-koncentráció között találtuk a dinamikus méréstartományt, míg a detektálás alsó határa 5x10^-3 pg/ml ZON értékűnek adódott. A karboxilcsoportokat tartalmazó szenzorral nyert immunszenzor dinamikus méréstartománya 10^-2-10² pg/ml közé esett, a detektálás alsó határa 2x10^-3 pg/ml ZON. Az optimalizált mérési eljárással mesterségesen szennyezett (spike) kukoricamintákat mérve a gátlási középérték (IC50) 0,053±0,013 pg/ml értékűnek adódott, míg az ELISA mérésnél meghatározható IC50 értéke 2,04±0,66 ng/ml volt. A kukoricaminták immunszenzorral mért eredményei valamint az ELISA referenciamódszerrel mért értékek között független kétmintás t-próba alapján P<0,05 szignifikanciaszinten nincs szignifikáns különbség.