Hisztamin meghatározására szolgáló immunszenzor fejlesztése

A fermentált zöldséglevekben megjelenő biogén aminok meghatározására alkalmas immunszenzort fejlesztettünk ki. Az optimalizált mérési eljárásról és a zöldséglevek mérési eredményeiről az Adányi és mtsai (2012) publikációban számoltunk be.

5.4.6.1. Hisztamin-BSA-konjugátum készítése

A versengő mérés kifejlesztéséhez szükség volt a szenzor felületén rögzíthető hisztaminkonjugátum elkészítésére. Mivel a kereskedelmi anti-hisztamin antitestet hisztamin-KLH-konjugátum ellen termeltették, így a hisztamin-BSA-konjugátum alkalmasnak ígérkezett a rögzítéshez. A BSA fehérjét szukcináltuk úgy, hogy a fehérjében kialakított karboxilcsoporthoz konjugáltuk a hisztamin antigént. Ezért 10 mg (16,7 µmol) BSA-t oldottunk 10 ml dikálium-hidrogén-foszfát-oldatban (0,2 M). Egy külön edényben 10 mg (100 µmol) borostyánkősav-anhidridet oldottunk 1 ml nátrium-hidroxid-oldatban (3 M), majd ezt az oldatot lassan, keverés közben a fehérjeoldathoz adtuk és 5 órán keresztül szobahőmérsékleten kevertettük. A keletkező oldatot desztillált vízzel szemben 2 napig dializáltuk, a desztillált vizet rendszeresen cseréltük, majd a terméket liofilizáltuk (11,3 mg termék).

1 2 3 4 5 6 7 +

-pH: 2,5

5,5 1 2 3 4 5 6 7 +

-pH: 2,5

5,5 1 2 3 4 5 6 7 +

-pH: 2,5

5,5 pH: 2,5

5,5

5.34. ábra Hisztamin-BSA-konjugátum poliakrilamid-gélelektroforézissel kapott képe (1. BSA, 2. szukcinált BSA, 3. hisztamin-BSA, 4. 1-2 keverék, 5. 2-3 keverék, 6. 1-3

keverék, 7. standard)

A szukcinált BSA 10 mg mennyiségét (0,16 µmol) 1,5 ml dimetil-formamidban oldottuk, és argongáz alatt 5,4 mg (72 µmol) NHS és 13,8 mg (72 µmol) EDC reagenseket adtunk hozzá. Az oldatot 2 órán át kevertettük szobahőfokon, majd szűrtük.

6,9 mg (62 µmol) hisztamint 0,35 ml dimetil-formamidban oldottuk, a 4 °C-ra hűtött és kevertetett reakciókeverékhez adtuk, majd további 24 órán át kevertettük (4 °C). Hét ml desztillált vizet adtunk a keverékhez és 1 napig desztillált vízzel szemben dializáltuk, a vizet rendszeresen cserélve. A keletkezett terméket poliakrilamid-gélen izoelektromos fókuszálással vizsgáltuk (6 mol/l karbamid és Ampholine, pH 3-10 jelenlétében, 5.34.

ábra). A tisztított termékként a hisztamin-BSA-konjugátum számított mennyiségének 82%-át sikerült kinyernünk, a termék összfehérje-tartalma 23,4 mg/ml értékűnek adódott Bradford módszerével mérve (Bradford, 1976).

83

5.4.6.2. Direkt immunszenzor kifejlesztése hisztamin meghatározására

A nem versengő eljárás során az anti-hisztamin antitestet rögzítettük a szenzor felületén, és közvetlenül mértük a standard oldatokban a hisztamin koncentrációját. A rögzítéshez szükséges antitest mennyiségét vizsgálva megállapítottuk, hogy a törzsoldatot 100x hígítva kaptunk stabil, reprodukálható jeleket. A hisztamin meghatározására alkalmas direkt immunszenzor méréstartománya 0,05-10,0 µg/ml volt, ami nem elégítette ki az élelmiszerekben levő hisztamin kimutatásának követelményeit (5.35. ábra).

10⁰ 10¹ 10² 10³ 10⁴ 10⁵ 5

10 15 20

tömeg/felület (egység)

hisztamin koncentráció (ng/ml)

5.35. ábra Hisztamin meghatározására alkalmas direkt immunszenzor kalibrációs görbéje (anti-hisztamin antitest 100x hígítva)

5.4.6.3. Versengő immunszenzor kifejlesztése hisztamin meghatározására

A versengő immunszenzor mérési protokolljának kidolgozása során a hisztamin-BSA konjugátumát rögzítettük a szenzor felületén, majd az antitestet feleslegben tartalmazó oldatot elegyítettük az antigénstandarddal, megfelelő ideig inkubáltuk, majd injektáltuk a rendszerbe és mértük a feleslegben maradt, az antigének által nem kötött antitestek mennyiségét. Vizsgáltuk a glutáraldehiddel rögzített hisztamin-BSA-konjugátum mennyiségének hatását a jelek nagyságára, stabilitására és a 10 µg/ml koncentrációjú oldat alkalmazása bizonyult megfelelőnek. Az antitest hígítási sorát (100x, 500x, 1000x, 2000x és 5000x) vizsgálva az anti-hisztamin antitest 1000x hígítását alkalmaztuk a további mérésekhez (~20 egység). A 10^-3-10² pg/ml méréstartományban vizsgáltuk a hisztamin standard oldatokra nyert jelek nagyságát, és megállapítottuk, hogy a kifejlesztett eljárással a dinamikus méréstartomány 10^-2-1 pg/ml, a gátlási középérték IC50 0,08±0,02 pg/ml értékűnek (szigmoidillesztés, χ²/szabadsági fok=0,19;), a kimutatás alsó határa 0,005 pg/ml értékűnek adódott.

5.4.6.4. Az immunszenzor szubsztrátspecifitása, fermentált zöldséglevekben lévő hisztamin koncentrációjának meghatározása

Vizsgáltuk, hogy a hisztamin meghatározására alkalmas immunszenzor a különböző biogén aminokkal mekkora jelet ad, és megállapítottuk, hogy a hisztamin szelektíven határozható meg az immunszenzorral, ha a különböző biogén aminok hasonló koncentrációban vannak jelen, mint a hisztamin. A hisztamin jelét 100%-nak véve, az azonos koncentrációjú putreszcinre 13,6%-os, kadaverinre 1,9%-os, agmatinra 4,3%-os keresztreakciót mértünk.

84

A különböző fermentált zöldséglevek hisztamintartalmát a kifejlesztett immunszenzorral vizsgáltuk (ld. 4.3.6. fejezet). Az előkészített mintákat 100x, 1000x és 10000x hígítottuk TRIS (42 mmol/l, pH 7,4) pufferrel, és mértük a hisztamintartalmukat. A 1:100 arányban hígított, hisztamint nem tartalmazó mintával a standard oldat jelénél lényegesen nagyobb, ~30-35 egység nagyságú jeleket kaptunk a mátrixhatás miatt. A jelek stabilak és jól kiértékelhetőek voltak, azonban csak 15-20 mintát lehetett egymás után mérni a szenzorral. Az 1000x hígított mintákkal továbbra is jól kiértékelhető jeleket kaptunk, és egy szenzorral 25-30 mintát mértünk egymás után.

A minták 10000x hígításával azok hisztamintartalma már a mérési tartomány alsó határának közelébe került, a jelek szórása igen nagy. Az eredményeket értékelve megállapítottuk, hogy az 1000x hígított minták mérésével lehetett a hisztaminkoncentrációt meghatározni. A minták hisztamintartalmát a pufferes standardokkal felvett kalibráció alapján határoztuk meg, a minták mátrixhatása a szűrés és a hígítás után nem okozott eltérést. Az immunszenzorral mért eredményeket a 4.2.5.3. fejezetben ismertetett HPLC eljárással meghatározott értékekkel hasonlítottuk össze. Az immunszenzorral mért értékek néhány minta esetében magasabbnak adódtak, mint a HPLC eljárással meghatározott hisztaminkoncentráció (pl. savanyú káposzta, kovászos uborka, tárolt csalamádé).

0 50 100 150 200 250

A B C D E F G H

biogén amin koncentráció (mg/l)

hisztamin (HPLC)

biogén aminok (normált HPLC) immunszenzor

5.36. ábra Zöldségléminták biogénamin-tartalmának összehasonlítása (A, B: savanyú káposzta, C: kovászos uborka, D: csalamádé friss, E: csalamádé tárolt, F,G,H:

fermentált sárgarépalé)

Tovább vizsgálva ezeknek a mintáknak a biogén amin-összetételét a HPLC eljárással nyert adatok alapján megállapítható, hogy a mintákban a hisztamin koncentrációjánál jóval nagyobb mennyiségben vannak jelen azok a biogén aminok, amelyek az immunszenzorral jelet adnak (putreszcin, kadaverin, agmatin). Ha ezeknek a biogén aminoknak a HPLC-vel meghatározott koncentrációját a specifitásuk %-ának arányában vettük figyelembe a kiértékelésnél (normált HPLC értékek), akkor igen jó egyezést (R²=0,97) kaptunk a fermentált zöldséglevek különböző technikával mért hisztaminkoncentrációja között (5.36. ábra). Mérési eredményeink szerint, ha az egyes biogén aminok a hisztaminnál lényegesen nagyobb koncentrációban vannak jelen a mintákban, jelentősen befolyásolják a szenzorral mért eredményeket. Ennek ellenére a szenzor gyors mérésre alkalmas, csak az adott határértéket meghaladó koncentrációt mutató mintákat kell a további vizsgálatokba bevonni.

85

Összefoglalásként megállapítható, hogy érzékeny, jelölésmentes immunszenzort fejlesztettünk ki fermentált zöldséglevek hisztaminkoncentrációjának gyors meghatározására. A versengő immunszenzor kialakításához elkészítettük a célvegyület-BSA konjugátumát és rögzítettük a szenzor felületén. A kifejlesztett eljárással a dinamikus méréstartomány 10^-2-1 pg/ml közé esett, a gátlási középérték (IC50) 0,08±0,02 pg/ml (szigmoidillesztés, χ²/szabadsági fok=0,19), a kimutatás alsó határa 0,005 pg/ml értékűnek adódott.

Fermentált zöldséglevekben lévő hisztamin koncentrációjának meghatározása során megállapítható, hogy ha az egyes biogén aminok (putreszcin, kadaverin, agmatin) a hisztaminnál lényegesen nagyobb koncentrációban vannak jelen, akkor ezek befolyásolják a szenzorral mért eredményeket. Ha az adott biogén aminoknak a HPLC módszerrel meghatározott koncentrációját az immunszenzorral mért keresztreakció %-ának arányában vettük figyelembe (normált HPLC értékek), akkor igen jó egyezést (R²=0,97) kaptunk a fermentált zöldséglevek különböző technikával mért biogén aminkoncentrációja között. Annak ellenére, hogy az immunszenzorral mért hisztaminkoncentrációt a különböző biogén aminok nagy koncentrációban való jelenléte befolyásolja, a szenzor gyors mérésre alkalmas, csak az adott határértéket meghaladó koncentrációt mutató mintákat kell a további vizsgálatokba bevonni.