Immunszenzor fejlesztése deoxinivalenol meghatározására

A búzán a szemek üszkösödését, kukoricában a kalász rothadását okozó, a F.

graminearum és a F. culmorum gombák termelte DON kimutatására nagyérzékenységű, szelektív immunszenzoros mérési módszer kifejlesztetésére került sor. Az eljárást és az eredményeket a Majer-Baranyi és mtsai (2011) tudományos közleményben ismertettük.

5.4.5.1. DON konjugátumok szintézise

Kétféle konjugátumot készítettünk OVA és BSA alkalmazásával. A konjugáláshoz mind a fehérjéket, mind a DON mikotoxint előkezeltük. Az előkészítéséhez a fehérjék 1-1 mg mennyiségéhez 0,24 ml desztillált vizet és 0,06 ml nátrium-perjodátot (0,1 M, 10 mmol/l nátrium-foszfátban) adagoltunk, az elegyet 20 percig rázattuk, majd dializáló zsákban hűvös helyen 1 napig 1 mmol/l nátrium-acetáttal szemben dializáltuk.

78

Az antigén előkészítésekor 3 mg DON mikotoxinhoz 30 µl acetonitrilt és 30 µl ecetsavanhidridet (4%, acetonitrilben), valamint katalizátorként 4-dimetil-amino-piridint adtunk, és 1 óráig kevertettük. Az egy óra elteltével 50 µl metanollal 5 percig kevertettük. Az előkészített fehérjékhez 36,6 µl előkezelt DON mikotoxint adtunk, és két óráig kevertettük, majd 20 µl 4%-os nátrium-borohidriddel még két órát kevertettük, végül a kész konjugátumokat gélszűrőn tisztítottuk. A tisztított DON-BSA-konjugátum 0,256 mg/ml fehérjét tartalmazott, míg a DON-OVA-konjugátum fehérjetartalma 5,31 mg/ml értékűnek adódott Bradford (1976) módszere alapján mérve.

A fehérjefrakciók ellenőrzésére a fehérjekonjugátumokat izoelektromos pont alapján szeparáltuk karbamidot tartalmazó poliakrilamid-gélben (4,35%, 7,2 mol/l karbamid), amely pH 3-10 tartományban alkalmas amfolitot tartalmazott a pH-gradiens biztosítására. A fókuszálás befejezése után a fehérjéket triklór-ecetsavban (15% w/v) rázatva fixáltuk, majd Coomassie Brilliant Blue G-250 festékkel detektáltuk. A futtatási kép alapján a standard mintáktól jól elkülönül a BSA-konjugátum és az OVA-konjugátum, tehát ezek a frakciók valóban a fehérje-DON konjugátumot tartalmazták.

5.4.5.2. Poliklonális ellenanyag előállítása, szérumok jellemzése

A DON-OVA-konjugátummal az 4.2.3. fejezetben ismertetett immunizációs eljárással termeltettük a poliklonális ellenanyagot, majd a szérum tisztítása (ld. 4.2.4.

fejezet), liofilizálása után a szérumokat ELISA rendszerben ellenőriztük (ld. 4.2.5.1.

fejezet). Megállapítottuk a szérumtitereket, a célvegyületek kötődésének erősségét, valamint a versengő ELISA rendszerben elérhető kimutatási érzékenységet. A termeltetett nyúlszérumok antigénnel szembeni aktivitását indirekt ELISA módszerrel vizsgáltuk (színreakció: torma-peroxidázzal jelölt anti-nyúl kecske IgG konjugátum, hidrogén-peroxid szubsztrát és OPD kromogén 492 nm-en mérve). A szérumtitrálás eredménye alapján az anti-DON szérumokat 200x illetve 500x hígítva alkalmasnak találtuk a DON ELISA mérési eljárással történő szelektív meghatározására. A két szérum fehérjetartalma (A, B) 127,0 mg/ml és 116,2 mg/ml volt, míg a tisztított szérumoké (C, D) 31,8 mg/mlés 39,2 mg/ml volt. Az ellenőrző ELISA mérés alapján a két szérum hasonló eredményt adott, de a B szérum nagyobb érzékenységet mutatott, ezért az abból tisztított D szérummal dolgoztunk a továbbiakban.

5.4.5.3. DON meghatározása direkt módszerrel

A DON direkt módon történő vizsgálatához az aminocsoportokat hordozó szenzor felületén glutáraldehiddel rögzítettük az antitestet különböző hígításban.

Mintaként 0,1-1000 ng/ml koncentrációjú DON-standardokat adagoltunk. Vizsgálataink során a legjobb eredményeket abban az esetben értük el, amikor a rögzítéshez 8 µg/ml koncentrációjú antitestoldatot alkalmaztunk. A kalibrációs görbe alapján a DON koncentrációjától függő jeleket csak a 0,1-100 ng/ml koncentrációtartományban kaptunk, ami az élelmiszerekből történő DON kimutatását nem teszi lehetővé.

5.4.5.4. DON meghatározása versengő módszerrel

A méréseket 120 µl/perc áramlási sebességgel, 24 °C-on termosztálva, 3 perc inkubációs idő elteltével végeztük. A DON-szelektív versengő immunszenzorok kialakításakor a szenzor felületén 512 ng/ml DON-BSA-konjugátumot rögzítettük glutáraldehiddel (2,5%), és különböző koncentrációjú (63,6; 15,9; 8,0; 6,4; 3,2; 2,5; 1,6 µg/ml) antitestoldatot injektáltunk (5.30. ábra). Amint az ábra alapján megállapítható, a nagy hígításban injektált szérumokra (3,2; 2,5; 1,6 µg/ml) mért jelek közel azonosak (21,46±0,48; 18,13±0,60; 17,05±0,89 egység), a görbék alakja bizonytalan. A tömény

79

szérum (63,6 µg/ml) által adott válasz alapján túl nagy jeleket (68,4±0,8 egység) mértünk. Az optimális szérumkoncentrációt 8 µg/ml értékűnek találtuk.

0 20 40 60 80

65 70 75 80

idő (min)

tömeg/terület (egység).

AB C D EF

5.30. ábra Szenzorjelek az anti-deoxinivalenol szérum hígításának függvényében (512 ng/ml DON-BSA; 120 µl/perc; 24 °C; anti-DON koncentráció: A: 63,6 µg/ml, B:

15,9 µg/ml, C: 8,0 µg/ml, D: 6,4 µg/ml, E: 3,2 µg/ml, F: 2,5 µg/ml, G: 1,6 µg/ml)

0 5 10 15 20

128 256 512

DON-BSA koncentráció (ng/ml)

∆ tömeg/felület (egység)..

0.1 1 10 DON (ng/ml)

5.31. ábra A DON-BSA-konjugátum koncentrációjának hatása a DON válaszjelére (8 µg/ml szérum; 120 µl/perc; 24 °C; 3 perc inkubációs idő)

Korábbi vizsgálataink már igazolták, hogy a szenzor felületén rögzített antigénkonjugátum mennyisége jelentősen befolyásolja a szenzorral mérhető jelek nagyságát és a mérés érzékenységét. A rögzítéshez 128, 256 és 512 ng/ml koncentrációjú DON-BSA-konjugátum oldatot injektáltunk a mérőcellába a szenzor felületére, és a 16 µg/ml töménységű szérumot alkalmaztuk a standardoldatok (0,1; 1;

10 ng/ml) mérésére (1:1 arányban elegyítve). A rögzítéshez 128 ng/ml DON-BSA-konjugátumot alkalmazva 21,7±1,2, 16,7±1,2 és 10,1±0,7 egység nagyságú jeleket mértünk, míg a 256 ng/ml koncentrációjú konjugátum rögzítése esetén a jelek ugyan csak kismértékben nőttek (23,3±0,7; 18,0±0,5, 12,7±0,5 egység), de a stabilitásuk lényegesen javult, szórásuk csökkent. Ugyanakkor 512 ng/ml koncentrációjú konjugátumot rögzítve a jelek ugyan nagyobbak lettek (29,4±0,3; 25,8±0,2 és 24,5±0,2

80

egység), azonban a jelek közötti különbségek szignifikánsan csökkentek. Az 5.31. ábra mutatja a DON-BSA-konjugátum koncentrációjának hatását a DON meghatározására a jelek csökkenését a vakoldathoz képest. Az eredmények alapján a további mérésekhez a rögzített DON-BSA-konjugátum koncentrációját 256 ng/ml értékűnek választottuk.

10^-4 10^-3 10^-2 10^-1 10⁰ 10¹ 10² 10³ 10

15 20 25 30 35

tömeg/felület (egység)

deoxinivalenol koncentráció (ng/ml)

5.32. ábra DON indirekt mérésének kalibrációs görbéje (256 ng/ml DON-BSA, 8,0 µg/mlantitest, statisztikai paraméterek: χ²/szabadsági fok= 1,57; r² = 0,99; IC50 értéke

0,15±0,08 ng/ml)

A DON meghatározására alkalmas immunszenzor működési paramétereinek meghatározása után kalibrációs görbét készítettünk 0,001-100 ng/ml koncentrációtartományban, és meghatároztuk a dinamikus mérési tartományt (5.32.

ábra). Az eredményeink alapján az indirekt mérési elven működő jelölésmentes immunszenzor dinamikus méréstartománya 0,005-50 ng/ml DON tartománynak, a LOD 0,001 ng/ml, míg a gátlási középérték (IC50) 0,15±0,08 ng/ml értékűnek adódott. Ez a méréstartomány két nagyságrenddel kisebb, mint a direkt szenzor esetében, és közel egy nagyságrenddel kisebb, mint a hasonló immunszenzorok SPR detektálással (Mak et al.

2010; Actis et al. 2010).

5.4.5.5. A DON immunszenzor tesztelése, búzalisztminták mérése

DON-mentes búzalisztmintából mesterséges szennyezéssel (spike) standardokat és „ismeretlen” mintát készítettünk. A mesterségesen szennyezett mintákból a 4.3.5.

fejezetben leírtak szerint készített acetonitril–víz-kivonatot készítettünk, majd a mintákat tovább hígítottuk TRIS pufferrel (42 mmol/l, pH 7,4), és immunszenzorral vizsgáltuk a minták mátrixhatását. A DON mikotoxinnal mesterségesen szennyezett mintákat 1000x, 10000x és 100000x hígítva injektáltuk az érzékenyített hullámvezető szenzorra, és megállapítottuk, hogy a minták mátrixhatása a 10000x hígításnál már nem zavarta a mérést. Ugyanakkor a jelek megfelelően stabilak és reprodukálhatóak voltak.

A mesterségesen szennyezett mintákkal nyert kalibrációs görbe alapján a lineáris méréstartomány a lisztmintára számolva 0,01-10 mg/kg, míg az IC50 értéke 0,13±0,04 mg/kg értékűnek adódott, ami megfelel a követelményeknek (max. 0,2 mg/kg DON lehet gyermekeknek szánt gabona alapú termékekben, 1,75 mg/kg DON lehet a feldolgozatlan durumbúzában, (Commission Regulation (EC) No 1881/2006) (5.33.

ábra). Az 5.11. táblázatban az „ismeretlen” minták mérési, visszanyerési eredményeit foglaltuk össze, és megállapítottuk, hogy a búzalisztből a DON mikotoxint a

minta-81

előkészítés során 90% fölött nyertük vissza, a minta-előkészítés és az immunszenzorral végzett meghatározás megfelelt a követelményeknek.

10^-4 10^-3 10^-2 10^-1 10⁰ 10¹ 10² 10

15 20 25 30 35 40

tömeg/felület (egység)

deoxinivalenol koncentráció (ng/ml)

5.33. Búzaliszt mintákban lévő DON kalibrációs görbéje (256 ng/ml DON-BSA; 8,0 µg/mlantitest, statisztikai paraméterek: χ²/szabadság fok= 1,90; r² = 0,98)

Hozzáadott DON (mg/kg)

Mért DON (mg/kg)

Visszanyerés (%)

0,005 0,006±0,002 123,0 0,01 0,011±0,004 114,0 0,05 0,05±0,01 92,0

0,1 0,11±0,02 108,2 0,5 0,47±0,05 94,5 1,0 1,1±0,1 109,3 5,0 04,7±1,3 93,1 10,0 11,0±1,0 111,0 50,0 46,0±4,3 91,6 5.11. táblázat Búzaliszt mintákban lévő DON visszanyerési eredményei

Összefoglalásként megállapítható, hogy sikeresen fejlesztettünk ki DON-tartalmának meghatározására szelektív immunszenzoros mérési eljárást. A DON mikotoxinból nátrium-perjodátos kezelés után konjugátumot készítettünk OVA és BSA alkalmazásával. A DON-OVA konjugátum segítségével poliklonális antitestet készítettünk. A biomolekulák alkalmazásával fejlesztettük ki a versengő immunszenzort. A DON-standardokat vizsgálva a dinamikus méréstartomány 0,005-50 ng/ml, a gátlási középérték (IC50) 0,15±0,08 ng/ml (χ²/szabadsági fok=1,57; r²=0,99), a kimutatás alsó határa 0,001 ng/ml értékűnek adódott. A deoxinivalenollal adalékolt búzalisztmintákkal nyert kalibrációs görbe alapján a dinamikus méréstartomány a lisztmintára számolva 0,01-10 mg/kg volt, a gátlási középérték (IC50) 0,13±0,04 mg/kg értékűnek adódott, ami megfelel az előírásokban foglalt követelményeknek.

82