Az antibiotikum rezisztencia 3 legelterjedtebb mechanizmusa: 1) az antibiotikum inaktivációja az azt módosítani képes enzimek túltermelése által, 2) az antibiotikum célpontjának módosítása, 3) a membrán permeabilitás csökkentése, vagyis az antibiotikum membránon való átjutásának a nehezítése. Az antibiotikum membránon való átjutása igazi kuriózum az aminoglikozidok esetében a kismolekulás antibiotikumok között, hiszen passzív diffúzió helyett a baktérium membránpotenciálját felhasználva, aktív felvétellel jutnak az aminoglikozidok a sejtbe. Az aminoglikozid rezisztencia összetett mivoltát sugallja, hogy az aminoglikozid-adaptált vonalak jóval több, átlagosan 11,4
24. ábra. Az egyes antibiotikum osztályokkal szemben adaptáltatott vonalak hiperszenzitivitása a többi antibiotikum osztállyal szemben.
64 mutációra tettek szert, mint a többi antibiotikummal szemben adaptált vonalak, melyekben átlagosan 5,65 mutációt tudtunk azonosítani.
Az aminoglikozidok közvetlenül a riboszómát támadják, ám a fehérje szintézist nem gátolják, ehelyett misztranszlációhoz vezetnek. A misztranszláció folyományaként hibás membrán fehérjék készülnek, melyeknek fontos szerepe van az aminoglikozidok által kiváltott oxidatív stresszben és azt követő sejthalálban29. Az aminoglikozidok sejtbejutása aktív respirációt, azaz membránpotenciált igényel217. Az aktív respirációhoz pedig szükséges a citokrómoknak és a légzési lánc többi komponensének a megfelelő működése29. Ahhoz, hogy feltárjuk, mely egységeit érintik mutációk az aminoglikozid-adaptált vonalakban ennek az összetett mechanizmusnak, útvonal feldúsulási analízist225 végeztünk.
Az útvonal feldúsulási analízis feltárta számos biológiai folyamat felül reprezentáltságát az aminoglikozid-adaptált vonalak által felhalmozott mutációk között. A várakozásainknak megfelelően az egyik fő szelekciós célpont a transzlációs gépezet volt. A transzlációs gépezet résztvevői között egyaránt hordoztak mutációt riboszómális fehérjék (RpsL), elongációs faktorok (FusA) és tRNS szintetázok. Továbbá számos olyan gén is mutációt hordozott, melyek a membrán transzport folyamatokban, a foszfolipid bioszintézisben, valamint a sejtmembrán és a sejtfal homeosztázis fenntartásában vesznek részt.
Kuriózumként a mutációt hordozó gének között szerepelt mind az oligopeptid transzporter OppF, melynek kulcsszerepe van a sejtfal fehérjék újrahasznosításában, mind a kétkomponensű, membrán stressz választ szabályozó CpxA226. A poliaminok, mint a putreszcin és a spermidin, bioszintézise szintén érintve volt. Ezek a molekulák csökkentik az aminoglikozid stressz következtében intracellulárisan termelődő reaktív oxigén gyökök termelődését215, és ezáltal csökkentik a fehérje és DNS károsodás mértékét29. Ezen felül a mutációt hordozó gének között igen elterjedtnek bizonyultak a közvetlen vagy közvetett módon a membrán elektrokémiai potenciálját befolyásoló gének. Ezen gének termékei részt vesznek az oxidatív foszforilációban, a proton-kálium szimportban (TrkH), az oxigénkötő hem bioszintézisében (HemA), valamint a citokróm terminális oxidáz komplexben (CyoB, CyoC). Emellett gyakran hordoznak mutációt az elektronszállítóként a respirációs elektrontranszport láncban résztvevő fehérjék is (IspA és a Nuo fehérje komplex), melyek hatással vannak a kinon készlet (quinone pool) alakulására is. Ez utóbbi csoportnak a legvalószínűbb a központi szerepe a járulékos érzékenység kialakulásában, már csak azért is, mert minden aminoglikozid-adaptált vonal hordozott legalább egy mutációt ebben az alrendszerben.
65 V.11. Az aminoglikozid-adaptált vonalak mutációinak kettős hatása a membrán permeabilitásra
Az aminoglikozid-adaptált vonalak által hordozott membránpotenciálra hatással levő mutációk mind az aminoglikozidok által kiváltott oxidatív stressznek, mind az aminoglikozidok felvételének a mértékét hivatottak csökkenteni. Azt feltételeztük ugyanakkor, hogy ez a csökkent membránpotenciál megnöveli számos más antibiotikummal szemben az érzékenységet. Feltételezésünk egyik alappillére, hogy az aminoglikozidok egyedülálló módon proton motoros erőt igényelnek a sejtbejutáshoz217,227. Feltételezésünk másik alappillére pedig, hogy számos más antibiotikum aktív effluxa szintén proton motoros erőt igénylő folyamat228. Ezen ismeretek alapján egy olyan modellt javasoltunk, mely szerint a kólibaktérium a gyors, kismértékű aminoglikozid rezisztencia eléréséhez drasztikusan lecsökkenti a membránpotenciált. Az ehhez szükséges rezisztencia mutációk pedig járulékos hatásként jelentősen csökkentik a főbb proton motoros erő függő efflux pumpák működését (25.
ábra). Modellünk megalapozottságának további alátámasztást ad az a korábbi két kísérletes munka, mely kimutatta, hogy a CCCP (mely az oxidatív foszforiláció kémiai gátlószere) csökkenti az aminoglikozidok sejten belüli felhalmozódását227, de emellett valószínűleg növeli az intracelluláris felhalmozódását számos más antibiotikumnak186.
25. ábra. Az aminoglikozid-adaptált vonalak járulékos érzékenységét okozó mechanizmus sematikus ábrázolása. Az ábrán használt rövidítések:
aminoglikozidok (AG), nem-aminoglikozid antibiotikumok (nonAG), külső sejtmembrán (OM), belső sejtmembrán (IM).
66 Első bizonyítékunkat a modellben javasolt mechanizmus meglétére az aminoglikozid-adaptált vonalakban azonosított mutációk biztosították, melyek jelentős része módosíthatja közvetlen vagy közvetett módon a baktérium membránpotenciálját (26.
ábra). A mutációt hordozó gének között szerepel például négy olyan gén (cyoB, ispA, nuoF és nuoE) melyek figyelemre méltó tulajdonságokon osztoznak: 1) a funkcionális kapcsolatuk az elektron transzporthoz irodalmi adatokkal alátámasztható, 2) az ezekben a génekben megfigyelt mutációk 57%-a frame-shiftet vagy in frame stop kodont okoz, tehát valószínűleg nem működő, hibás fehérjék termelődéséhez vezet, 3) ezen gének deléciója a kemogenomikai adatsor alapján növeli az aminoglikozid rezisztenciát, míg más antibiotikumokkal szemben érzékenyít.
A megfigyelt mutációkon túl további két biokémiai vizsgálat is alátámasztotta az általunk javasolt modellt. Első lépésként megmértük, hogy az aminoglikozid-adaptált vonalakban valóban csökkent-e a membránpotenciál. A membránpotenciált a dietiloxakarbocianin-jodid (DiOC2) membránpotenciál indikátor fluoreszcens festék segítségével határoztuk meg184. Modellünket eredményeink maximálisan alátámasztották: a membránpotenciál jelentősen csökkent az aminoglikozid-adaptált vonalakban (27. ábra, bal oldali panel).
További bizonyítékként az aminoglikozid-adaptált vonalak emelkedett intracelluláris Hoechst 33342 fluorescens festék felhalmozódást mutattak (27. ábra, jobb oldali panel), mely vagy a megnövekedett porin aktivitással, vagy az efflux pumpák csökkent működésével magyarázható186. (A Hoechst 33342 festék a sejtbe jutva a DNS-hez kötve ad ki detektálható fluorescens jelet, így a sejtbeli felhalmozódása microtiter lemez
26. ábra. Az aminoglikozid-adaptált vonalak járulékos érzékenységét okozó mechanizmus hátterében azonosított mutációk. Az ábrán használt rövidítések:
aminoglikozidok (AG), külső sejtmembrán (OM), belső sejtmembrán (IM).
67 leolvasóval egyszerűen nyomon követhető. A festék a porin csatornákon jut a sejtbe és a multidrog efflux pumpák (pl.: AcrAB-Tolc) szubsztrátjaként aktív effluxszal tud távozni onnan.) Az aminoglikozid-adaptált vonalakkal szemben a többi antibiotikum osztály tagjaihoz adaptált vonalak csökkent Hoechst 33342 felhalmozódást mutattak a kiindulási törzshöz képest. Ez utóbbi mintázat összhangban van azzal a megfigyelésünkkel, hogy a nem-aminoglikozid antibiotikumokhoz adaptált vonalakban rendkívül elterjedtek az AcrAB-Tolc multidrog efflux pumpa expresszióját befolyásoló mutációk.
V.12. A trkH gén egyetlen pontmutációja is széleskörű járulékos