Számos jelentős fertőző betegség, például a HIV fertőzés, a tuberkulózis és a malária esetében, a kombinációs terápia a standard eljárás, s ezeknek a kombinációs terápiáknak a fő célja a rezisztencia kialakulásának késleltetése152–155. Ezzel szemben az átlagos akut
27 bakteriális fertőzésekre nagyon kevés esetben alkalmaznak kombinációs terápiát, és akkor is kizárólag azzal a céllal, hogy a két alkalmazott antibiotikum felerősítse egymás hatását, tehát a szinergisztikus hatás kiaknázására156. A szinergisztikus antibiotikum párok terápiás alkalmazásakor valóban gyorsabb a tisztulás (clearance), ráadásul alacsonyabb antibiotikum dózis mellett156,157. Ez az egyoldalú hozzáállás az antibiotikum kölcsönhatásokhoz ugyanakkor rendkívül káros is lehet: egy laboratóriumi evolúciós kísérletben ugyanis azt találták, hogy a szinergisztikus antibiotikum párokkal szemben sokkal gyorsabban alakul ki a rezisztencia, mint a más kölcsönhatást mutató párokkal szemben, sőt még annál is gyorsabban, mint az egyedileg alkalmazott antibiotikumokkal szemben158. Ahhoz tehát, hogy kiaknázhassuk az antibiotikum terápiák esetében is a kombinációs terápiában rejlő maximális lehetőségeket, az antibiotikum kölcsönhatások sokkal átfogóbb ismeretére lenne szükségünk156. Az antibiotikum kölcsönhatásoknak két csoportját ismerjük: a fiziológiás és az evolúciós kölcsönhatásokat. Az antibiotikumok fiziológiai kölcsönhatásai már az 1950-es évek óta ismertek159, az evolúciós kölcsönhatások jelentőségére pedig a jelen munka alapjául szolgáló publikációinkkal hívtuk fel a nemzetközi szakma figyelmét, melyet azóta számos új publikáció követett a témában.
Fiziológiás kölcsönhatások160. A fiziológiás kölcsönhatások megjelenéséhez két vagy több antibiotikum egyidejű jelenléte szükséges. Fiziológiai kölcsönhatásról valójában akkor beszélhetünk, ha a két egyidejűleg jelenlévő antibiotikum együttes hatása erősebb vagy gyengébb, mint amire az antibiotikumok egyedi hatása alapján számítanánk. A legegyszerűbb ezeket a kölcsönhatásokat úgy elképzelni, ha a két antibiotikum koncentrációs terére rárajzoljuk, hogy a baktérium adott kölcsönhatásnál mekkora területen képes növekedni (7. ábra). A koncentrációs térben „A” antibiotikum koncentrációja az x-tengely mentén, míg „B” antibiotikum koncentrációja az y-tengely
7. ábra. Az antibiotikumok között megfigyelhető fiziológiai és evolúciós kölcsönhatások (Baym és mtsai, 2016 nyomán)160.
28 mentén növekszik. A tér minden pontja tehát a két antibiotikumnak a két tengelytől való távolsággal arányos, az adott pontnak megfelelő koncentrációjú kombinációját képviseli.
Az alap feltételezésünk, hogy a két antibiotikum hatása összeadódik (összeadódó vagy additív kölcsönhatás), tehát mindegy, hogy melyik antibiotikumból mennyi szerepel a kombinációban, ha a kombináció összesített koncentrációja azonos, a hatás is azonos lesz.
Ebben az esetben a növekedési zóna egy egyenes mentén ér véget. Szinergizmus esetében a kombináció erősebben hat, tehát jobban gátolja a baktérium növekedését, mint amit az összeadódó hatás esetében várnánk. Ebben az esetben tehát a növekedési zóna széle konkáv, a két antibiotikum felerősíti egymás hatását. Antagonizmus esetében a kombináció gyengébben hat, tehát kevésbé gátolja a baktérium növekedését. A növekedési zóna széle ebben az esetben konvex, a két antibiotikum gyengíti egymás hatását. A fiziológiás kölcsönhatások terápiás hasznosításának egyik legáltalánosabban ismert példája a szinergisztikus trimetoprim - szulfametoxazol kombináció alkalmazása középfülgyulladás fertőzések kezelésére156,161.
Evolúciós kölcsönhatások. Az evolúciós kölcsönhatások nem a klasszikus értelemben vett kölcsönhatások, tehát ilyenkor a két antibiotikum nem egy időben, nem kombinációban van jelen. Az evolúciós kölcsönhatások egy adott antibiotikumra adott evolúciós válasznak a következményei, tehát a spontán megjelenő rezisztencia mutációk vagy a szerzett rezisztencia gének által jönnek létre: ugyanaz a mutáció vagy gén mely egy adott antibiotikumra rezisztenciát biztosít, más antibiotikumokkal szemben is megváltoztatja a baktérium érzékenységét160. Amennyiben az adott rezisztencia mutáció vagy gén több antibiotikumra is rezisztenciát okoz, keresztrezisztenciáról vagy multidrog rezisztenciáról beszélünk. Abban a rendkívül izgalmas esetben azonban, amikor az adott rezisztencia mutáció vagy gén egy másik antibiotikumra fokozott érzékenységet (hiperszenzitivitást) okoz, járulékos érzékenységről (kollaterális szenzitivitásról) beszélünk. Ez utóbbi jelenséget egy körülbelül 60 évvel ezelőtti úttörő munkában publikálták először21. Ebben az úttörő munkában az akkori laboratóriumi lehetőségek ellenére rendszerszinten vizsgálták 15 antibiotikum evolúciós kölcsönhatásait. A kísérlet során elsősorban az antibiotikumok hatásmechanizmusa közötti hasonlóságokat és eltéréseket célozták vizsgálni. A járulékos érzékenység nem kizárólag az antibiotikumokra jellemző jelenség:
jelentőségét felvetették már a rovarirtó rezisztencia162,163, a malária164,165, a HIV terápia166 és a rákterápia23 területén is.
29 III. Célkitűzés
Munkám céljaként azt tűztük ki, hogy választ adjunk napjaink egyik legsürgetőbb kihívására, miszerint megértsük, milyen genetikai változások jönnek létre a de novo antibiotikum rezisztencia evolúciója során, valamint ezek az adaptív változások hogyan befolyásolják az adott baktérium érzékenységét más antibiotikumokkal szemben. Ezen evolúciós kölcsönhatások rendszerszintű vizsgálatának elvégzéséhez a következő részfeladatokat tűztük ki:
Az antibiotikum rezisztencia evolúciót meghatározó evolúciós hajtóerők vizsgálata nagyléptékű laboratóriumi evolúciós kísérlet, valamint teljes-genom szekvenálás segítségével, Escherichia coli baktériumban.
A keresztrezisztencia és járulékos érzékenység kölcsönhatások feltérképezése 12 klinikailag releváns, változatos hatásmechanizmusokat képviselő antibiotikum között egy saját fejlesztésű, nagy áteresztőképességű antibiotikum érzékenységi szűrés segítségével.
Az evolúciós és a fiziológiás antibiotikum kölcsönhatások közötti összefüggések vizsgálata.
A keresztrezisztencia kapcsolatok mintázatát meghatározó legfőbb irányelvek megértése.
A járulékos érzékenység jelenségének hátterében álló molekuláris mechanizmusok részletes feltárása biokémiai vizsgálati módszerek használatával. Annak feltárása, hogy milyen gyakori a járulékos érzékenység és kihasználható-e a klinikai alkalmazásban?
30 IV. Anyag és Módszer
IV.1. Alkalmazott antibiotikumok, tápoldat és baktérium