A laboratóriumi evolúció végén, az egyes antibiotikumokkal szemben adapatáltatott 10-10 független párhuzamos vonalból kiválasztottunk összesen 63-at (5-6 vonalat antibiotikumonként), melyekből egyedi kolóniákat izoláltunk teljes-genom szekvenálásra, azzal a céllal, hogy feltérképezzük a rezisztencia mögött rejlő változatos molekuláris mechanizmusokat. A teljes-genom szekvenálás SOLiD platformon zajlott (Applied Biosystems). A mutációk sikeres azonosításához az evolúciós kísérlet kiindulási törzse is szerepelt 64.-ként a szekvenált vonalak között. Mivel ekkor még az általunk alkalmazott Escherichia coli BW25113 törzsre nem állt rendelkezésünkre az azóta már elkészített referencia genom192, így első lépésben mind a 64 szekvenált vonalunkhoz a Escherichia coli K-12 MG1655 törzs teljes-genom szekvenciáját alkalmaztuk referencia genomként193, majd ezután az egyes adaptált vonalak mutációit a kiindulási törzsünkben azonosított mutációkhoz viszonyítva azonosítottuk a laboratóriumi evolúció során megjelent mutációkat. A teljes-genom szekvenálást, a nyers szekvencia adatok elemzését, majd az adatelemzési eljárás validálását a Szegedi Biológiai Kutatóközpont Szekvenáló Platformja végezte, Nagy István szakmai vezetésével.
10. ábra. Az evolúciós kísérlet során párhuzamos vonalanként megjelenő átlagosan 5-6 mutációval szemben, a megnövekedett mutációs ráta következtében a CPR6
vonal 55, míg az AMP6 vonal 136 mutációt hordozott. A Luria–Delbrück féle fluktuációs teszt alapján az AMP6 és CPR6 vonalak mutációs rátája közel 3
nagyságrenddel növekedett az evolúciós kísérlet során.
45 A mutátor fenotípus megjelenését és gyors elterjedését leírták már mind laboratóriumi evolúciós kísérletekben194, mind klinikai izolátumok esetében195. Ennek hátterében valószínűleg az áll, hogy a gyakran több nagyságrenddel megemelkedett mutációs ráta lehetővé teszi a gyorsabb adaptációt olyan erős szelekciós nyomással szemben, mint például amit bizonyos antibiotikumok okoznak196,197. A mutációs ráta növekedését többnyire a DNS hibajavítási mechanizmusokat károsító mutációk okozzák194,195. Ezekkel a megfigyelésekkel összhangban 2 adaptált vonalunk (AMP6 és CPR6) is kiugróan nagyszámú mutációt hordozott magában (10. ábra, bal oldali panel). A két vonalban azonosítani tudtuk azokat a mutációkat, melyek feltehetően a mutációs ráta növekedéséhez vezettek. A ciprofloxacinnal (CPR) szemben adaptáltatott CPR6-os vonal összesen 55 mutációt hordozott, melyek között szerepelt a hibás bázispárosodás javításáért felelős MutL DNS mismatch repair fehérjét kódoló génben egy kereteltolódást okozó (frameshift) mutáció (Val303fs) 198. Az ampicillinnel (AMP) szemben adaptáltatott AMP6-os vonal még számottevőbb, összesen 136 mutációval rendelkezett, melyek egyike a dnaQ gént érintette és okozott aminosav szubsztitúciót (Ile9Ser). A dnaQ gén az általános DNS polimeráz enzim (Pol III) hibafelismerésért felelős ε alegységét kódolja199. A két vonal mutációs rátájában bekövetkező változást Luria–Delbrück féle fluktuációs teszttel igazolta kollégám, Dr. Méhi Orsolya (10. ábra, jobb oldali panel). A mutátor fenotípus következtében ezek a vonalak számos olyan mutációt halmoztak fel, melyek az antibiotikum szelekciós nyomástól függetlenül voltak jelen a két vonalban, ezért ezeket a vonalakat minden későbbi elemzésből kizártuk.
A további 61 adaptált vonalban összesen 402 független mutációs eseményt azonosítottunk (5.-7. függelék). A mutációk között egyaránt voltak pontmutációk, inzerciók, valamint kis és nagy genomi átrendeződések. Átlagosan vonalanként 4,2 pontmutációt, 1,2 deléciót, 0,26 inzerciót és 0,07 duplikációt azonosítottunk. A deléciók
11. ábra. A deléciók hossza általában 100 bázispár (bp) alatt maradt, azonban 19 esetben a 100 bázispárt (bp) meghaladta, s akár 61 génre is kiterjedt.
46 általában rövidek voltak (1-100 bázispár között), azonban 19 esetben a deléció 0,3-58 kilobázis hosszú szakaszra nyúlt, ezzel eltávolítva 1-61 gént (11. ábra). Az IS-elem alapú genomi átrendeződések (inverziók, transzpozíciók és duplikációk) az adaptált vonalak 59%-ában voltak jelen.
Számos bizonyíték utal arra, hogy a fehérje kódoló régiókban azonosított mutációk megjelenését az antibiotikum által okozott szelekciós nyomás vezette. Egyrészt a pontmutációk 87%-a nem csendes (szinoním) mutáció volt, azaz a kódolt aminosav megváltozásához vezetett. Másrészt pedig az adaptált vonalakban azonosítottunk számos olyan mutációt, mely nem csupán a gén szintjén, hanem a mutáció által okozott aminosav szubsztitúció szintjén is megegyezett az irodalomban leírt környezeti vagy klinikai rezisztens izolátumokban azonosított rezisztencia mutációkkal (3. táblázat). Ez utóbbi azért is rendkívül fontos, hiszen bemutatja, hogy a klinikumban előforduló genomi rezisztencia mutációk egy része előjelezhető egyszerű laboratóriumi evolúciós kísérletek segítségével.
A korábbi kutatások eredményeivel összhangban az antibiotikum rezisztencia kialakulásának a laboratóriumi evolúciós kísérletünk során is mérhető fitnesz költsége volt: az adaptált vonalak mintegy 41%-a szignifikáns fitnesz csökkenést mutatott antibiotikum-mentes tápoldatban a kiindulási törzshöz viszonyítva. Az egyes vonalak fitneszét egy optikai sűrűség (OD600) értéken alapuló méréssel becsültük meg, majd az adaptált vonalak eredményeit a kiindulási törzzsel összevetve kaptuk meg a relatív fitnesz értékeket. A különösen alacsony fitnesszel rendelkező vonalak kiugróan nagy számú 3. táblázat. A laboratóriumi evolúció végpontjában azonosított mutációk átfedése a
klinikumból és környezeti mintákból izolált rezisztens törzsekben talált genomi mutációkkal.
47 mutációt hordoztak magukban (12. ábra, bal oldali panel, N=61, Kruskal Wallis teszt P<10-4), valamint gyakran hordoztak nagyobb genomi deléciókat (12. ábra, jobb oldali panel, N=61, T-próba P=0,0014). A mutációk kiugróan magas száma és a nagyméretű genomi deléciók jelenléte gyakran azonos vonalakban volt megfigyelhető. Ez alapján feltételezhetjük, hogy bizonyos antibiotikumokhoz nagyobb kihívás alkalmazkodni és csak összetettebb rezisztencia mechanizmusok által lehetséges magas rezisztenciát elérni, s ez, mint eredményeink mutatják, nagyobb mértékű fitnesz költséghez vezet.