Sejtrögzítési technikák

Számos sejtrögzítési módszer az enzimek rögzítési technikáinak módosításával, fejlesztésével jött létre. Természetesen a sejtek nagyobb mérete befolyásolta ezeket a módszereket és számos újat eredményezett (BRODELIUS&VANDAMME 1991). A sejtek rögzítése négy alapelv szerint lehetséges:

• A sejtek egymással való keresztkötése bi- vagy multifunkcionális reagensekkel.

• Kovalens kötés előformázott hordozóhoz.

• Adszorpció előformázott hordozóhoz.

• Bezárás részecskékbe, rostokba vagy mikrokapszulába.

A sejtrögzítési módszerek csoportosítását a 4. ábra mutatja be.

SEJTRÖGZÍTÉSI MÓDSZEREK

Rögzítés hordozóval Rögzítés hordozó nélkül

Kötés Bezárás

Keresztkötés Folyékony

membránba zárás Gélbezárás

Hordozóhoz kötés

Adszorpció Kovalens kötés

4.ábra. Sejtrögzítési módszerek

A sejtrögzítési technikákat az alábbi csoportokba sorolják.

2.5.1.1 Sejtrögzítés hordozó nélkül

A természetes módon aggregálódó, összetapadó, pelletet alkotó vagy flokkuláló sejtek is tekinthetők immobilizált sejteknek. A folyamatot mesterségesen is elő lehet idézni kémiai anyagokkal vagy genetikai módosítással. A jelenségben kulcsszerepet játszó sejtfal régiót biológiai és környezeti tényezők is befolyásolják az anyagcserén keresztül, közvetlenül vagy közvetve (JIN&SPEERS 1998, WILLAERT et al. 1996). A mesterséges flokkulációt elősegítő szerek vagy a keresztkötést létrehozók fokozhatják/elősegíthetik az aggregációs folyamatot azon sejtek között is, amelyek természetes körülmények között nem flokkulálnak. Genetikai szinten is vizsgálták a mechanizmust, ami a flokkulációt szabályozza a Saccharomyces cerevisiae élesztőben, és 3 gént írtak le és jellemeztek (FLO1, FLO5 és FLO8). A géneket sikeresen átvitték nem-flokkuláló élesztőbe is (JIN&SPEERS 1998).

2.5.1.2 Keresztkötés

A mikroorganizmusok sejtfala szabad amino- és/vagy karboxil-csoportokkal rendelkezik.

Keresztkötés könnyen kialakítható ezek között olyan bi- vagy multifunkcionális reagensekkel, mint a glutáraldehid vagy a toluén diizocianát. A mikrobasejtek rögzíthetők ionos keresztkötéssel is úgy, hogy polielektrolitok hozzáadásával flokkulációt váltanak ki. Önmagában ritkán alkalmazzák ezt a rögzítési módszert, viszont gélbezárással kombinálva stabilabbá teszi a gél szerkezetét (BRODELIUS&VANDAMME 1991).

2.5.1.3 Kovalens kötés

A sejt rögzítése kovalens kötéssel egy hordozóhoz lehetséges (1) a mátrixon található reakciós csoporton keresztül vagy (2) egy vegyület segítségével, ami a sejtet a hordozóhoz köti. Ez utóbbira példa lehet a BrCN aktivált cellulóz vagy a glutáraldehiddel kombinált zselatin. Ugyan az irreverzibilis kovalens kötéssel rögzített sejteket tartalmazó rendszerben nincs korlátozva a diffúzió (mint gélbezáráskor), és kevésbé van kitéve az új sejtek kiáramlásának (mint adszorpció esetén), ám az összekötést biztosító vegyületek legtöbbször rendkívül mérgezőek és károsítják a sejteket (BRODELIUS&VANDAMME 1991).

2.5.1.4 Adszorpció

Ennek a rögzítési módszernek legfőbb vonzereje az, hogy egyszerű és gyorsan kivitelezhető. Ez részben annak is köszönhető, hogy a mikroorganizmusoknak természetesen is hajlama van arra, hogy valamely felülethez kötődjenek. A kötődést befolyásolja a sejtet körülvevő oldat pH-ja, a sejt fiziológiai állapota, a sejt típusa és annak környezete is. Használatakor figyelembe kell venni, hogy a sejtek és az oldat között válaszfal nincs, állandó a sejtek leválása (és újrarögzülése), ezért nem megfelelő olyan alkalmazásban, ahol a rendszerből kiáramló oldatnak sejtmentesnek kell lennie (KLEIN&ZIEHR 1990, WILLAERT et al. 1996, BICKERSTAFF 1997). Az adszorpciós rögzítéshez használt hordozóknak két nagy csoportja van: a szerves és a szervetlen adszorpciós hordozók. Tipikus szerves adszorpciós hordozók az ion-cserélő gyanták (szintetikus polimerek), a cellulóz származékok és a lektinek. Gyakran alkalmazott szervetlen hordozó a porózus üveg és a kerámia, de a szerves hordozók csoportja is igen széleskörű: rögzíthetnek sejteket faforgácsra, kovaföldre, PVC-re, DEAE-cellulózra (BRODELIUS&VANDAMME 1991).

2.5.1.5 Gélbezárás

Egyszerűsége és kiváló sejtvisszatartó képessége miatt a gélbezárás módszere az egyik legtöbbet alkalmazott sejtrögzítési technika. A bezárt sejtek nagy sűrűséget érhetnek el a mátrixban és a sejtek jól védettek a nyíróerőtől. Számos természetes és szintetikus polimer alkalmas arra, hogy hidrofil mátrixszá gélesedjen, és olyan kíméletes körülmények között tegye ezt, ami a lehető legkisebb

sejtkárosodással jár (5. táblázat). A szintetikus polimerek mechanikai stabilitása és élettartama lényegesen jobb, mint a természetes polimereké. Ezzel szemben a sejtek növekedése és a szén-dioxid képződés könnyen tönkreteszi a természetes géleket. Megerősítésük lehetséges más anyagokkal, pl. keresztkötések létrehozása glutáraldehiddel vagy akár a gél részleges kiszárítása révén. (WILLAERT et al. 1996, BICKERSTAFF 1997, KOURKUTAS et al. 2004).

5.táblázat Sejtek gélbezárásos rögzítésére alkalmas módszerek (BRODELIUS&VANDAMME 1991) GÉL KIALAKULÁSÁNAK

MECHANIZMUSA

P^OLIMER POLIMER TÍPUSA

Polimerizáció Poliakrilamid, polimetakrilát szintetikus polimerek Keresztkötés Különböző prepolimerek, fehérjék szintetikus polimerek Polikondenzáció Poliuretán, epoxi gyanta szintetikus polimerek Gélesedés hő hatására Kollagén, zselatin, agar/agaróz, κ-karragén természetes polimerek

Ionotróp gélesedés Alginát, kitozán természetes polimerek

Kicsapódás Cellulóz, cellulóz tri-acetát természetes polimerek

A sejtek bezárásos rögzítésére alkalmas hordozók harmadik nagy csoportja – a szintetikus és természetes polimerek mellett – a membrán reaktorok. A sejtek a porózus membrán egyik oldalán helyezkednek el és a szubsztrátum oldatot cirkuláltatják a membrán másik oldalán. A porózus membrán lehetővé teszi, hogy a szubsztrátum és a termék a sejtekhez diffundáljon. Rendkívül kíméletes rögzítési módszer.

2.5.1.6 Folyékony membránba bezárás

Ebben az esetben tulajdonképpen egy kétfázisú bezárás történik, ahol a gát, – ami immobilizálja a sejteket – egy folyadék/folyadék fázis határfelülete két nem elegyedő folyadék között (WILLAERT et al. 1996).

2.5.1.7 Komplex rögzítési eljárások

A sejtek rögzítése történhet két (esetleg három) módszer kombinációjával is, amivel kihasználható mindkét eljárás előnye. Mint a 2.5.1.2 fejezetben említettem a keresztkötéses rögzítést csak másik immobilizálási módszerrel kombinálva alkalmazzák. Több módszer együttes használatának hatékonyságát jelzi, hogy az első ipari méretű, immobilizált sejteket tartalmazó, sör ászokolására alkalmas rendszerben is ezt alkalmazzák: a Spezyme hordozó DEAE-cellulóz-polisztirol-TiO2-ből épül fel, a sejtek pedig ionos kötés-adszorpció-fémkelát képződés kombinációjával rögzülnek.

Leggyakoribb komplex eljárások:

• flokkulálás + adszorpció,

• telepképzés (kolonizáció) porózus adszorbensen,

• fotokatalitikus polimerizáció (keresztkötés) + gélbezárás,

• adszorpció + keresztkötés,

• ionos kötés + adszorpció + fémkelát.