A Saccharomycodes ludwigii élesztő killer aktivitásának vizsgálata

Az idegen élesztő killer aktivitását többféleképpen is megvizsgáltam. Minden esetben a S. cerevisiae WS 34/70 sörélesztőt és a S. cerevisiae S6 szuperszenzitív élesztőt alkalmaztam teszt élesztőként. Természetesen arra kerestem választ, hogy a sörélesztővel szemben aktív-e a toxinja – ha egyáltalán termel ilyen vegyületet – vagy nem. Egy korábbi vizsgálatban bebizonyosodott, hogy van olyan killer toxin, amire ez a sörélesztő törzs rezisztens. Ezért a szuperszenzitív élesztő arra az esetre szükséges, ha ebben a vizsgálatban is ez történne.

Agar diffúziós módszert alkalmaztam a kísérletekben. Két tápközeget használtam, amiben megpróbáltam toxint termeltetni. Egyrészt sörlevet, ami a korábbi vizsgálatokban szerepelt, másrészt YEPD tápközeget. Erre azért volt szükség, mert ez utóbbiban a glükóz az egyedüli szénforrás, amit a S’codes ludwigii maradéktalanul hasznosítani tud. A sörlében a szaporodásának sebessége módosulhat a jelenlévő szénhidrátok miatt, ami befolyásolhatja a toxin termelést is.

Végül pedig, a vizsgálatokat úgy is elvégeztem, hogy az idegen élesztő sejteket a metilénkékes agaron masszívan leoltott teszt élesztőkre kaccsal húztam ki. Azért éreztem szükségét ennek a módszernek, mert ha csak kevés toxint termel az idegen élesztő, akkor a nagy koncentrációban jelen lévő sejtekkel kimutatható az aktivitása, míg esetleg a felülúszóban nem jelenik meg olyan mennyiségben, hogy hatása látható legyen.

Az első képen a sörléből és a YEPD tápközegből nyert felülúszók vizsgálata látható. A teszt élesztő a S. cerevisiae S6 szuperszenzitív törzs volt. Kontrollként a K1 típusú toxint termelő S. cerevisiae ATCC 46305 törzset használtam (30. ábra).

Sörlé YEPD

30.ábra. Saccharomycodes ludwigii élesztő killer aktivitásának vizsgálata agar diffúziós módszerrel

A vizsgálat szerint a Saccharomycodes ludwigii sem YEPD tápközegben, sem sörlében nem termelt kimutatható mennyiségű toxint. Feltisztulási zónát csak az ismerten toxint termelő élesztő sejt képzett (K1).

A kísérletet megismételtem úgy, hogy kaccsal húztam ki az idegen élesztő sejtjeit. Ez alkalommal a S. cerevisiae WS 34/70 törzs is szerepelt teszt élesztőként (31/a és b ábra). Kontrollként azt a három

killer élesztőtörzset használtam, amit korábban a protoplaszt fúzióban is alkalmaztam: S. cerevisiae ATCC 46305 (K1 típusú), S. cerevisiae NCYC 738 (K2 típusú) és S. cerevisiae K7 (K1 típusú).

A B

31/a. és b. ábra. Saccharomycodes ludwigii élesztő killer aktivitásának vizsgálata

A két kép tanúsága szerint a S’codes ludwigii élesztő nem képzett feltisztulási zónát. Az elvégzett vizsgálatokból arra következtettem, hogy a Saccharomycodes ludwigii élesztő nem termel toxint.

5.3.2 A Saccharomyces cerevisiae WS 34/70 sörélesztő és a Saccharomycodes ludwigii élesztő kölcsönhatásának vizsgálata kevert kultúrás erjesztésekkel

A kevert kultúrás erjesztéseket a 4.2.5.2 fejezetben leírt módon végeztem. A korábbi vizsgálatokhoz képest módosítottam a sörélesztő sejtek és idegen élesztő sejtek kimutatásának módszerén. Ez alkalommal NISSEN és munkatársai (2003) által leírt telepszámlálással állapítottam meg a sejtek koncentrációját (4.5.2 fejezet). A lizin agaron csak a S’codes ludwigii sejtek nőnek ki, míg a YEPD agaron mindkét élesztő sejtjei. Így az idegen élesztő sejtkoncentrációját direkt módon kaptam meg.

A sörélesztő sejtkoncentrációját indirekt módon: kivonva a lizin agaron kapott eredményt a YEPD agaron kapott eredményekből. A minták szénhidráttartalmát HPLC-n határoztam meg.

Az élesztők kölcsönhatását két különböző hőmérsékleten tanulmányoztam: 8°C-on és 20°C-on.

5.3.2.1 Kölcsönhatás vizsgálat 8°C-on. I. erjesztési kísérlet

Ezen a hőmérsékleten két kezdő sörélesztő:idegen élesztő koncentráció arányt állítottam be: 1:1 és 1:10. Az 32. ábrán a 73 órás erjesztés során tapasztaltak láthatók.

1:1 1:10

32.ábra. A sörélesztő és az idegen élesztő sejtkoncentrációjának alakulása valamint a szénhidrátok mennyiségének változása 1:1 és 1:10 kezdő sejtarányoknál

Az eredmény várakozásaimmal ellentétben alakult az 1:1 kezdő aránynál. A korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy a sörélesztő egyenlő kezdő sejtszám esetén túlsúlyba kerül az idegen élesztővel szemben. Ebben az esetben 73 óra után a S’codes ludwigii élesztő nagyobb arányban volt jelen. A szénhidrát vizsgálat eredményéből úgy tűnik, hogy a glükóz felhasználásából az idegen élesztő profitált a erjesztés alatt. Ezt a fermentációt nem követtem tovább, de nem kizárható, hogy a sörlében maradt maltózt és maltotriózt felhasználva a sörélesztő a továbbiakban még növekedne, míg az idegen élesztő sejtszáma stagnálna.

Az 1:10 kezdő sejtaránynál az első 49 órában nagyon hasonlóan alakult a sörélesztő és idegen élesztő sejtkoncentrációja. A következő két mintavételnél azonban már S. cerevisiae sejteket nem mutatott ki a vizsgálat. A szénhidrátok maradék mennyisége a tápközegben alátámasztotta az eredményeket. A korábbi erjesztéskor azt az eredményt kaptam, hogy a sörélesztő sejtek ennél a kezdő sejtaránynál már visszaszorultak az egy hetes erjesztés végére, mindössze a sejtek 20%-át adták.

5.3.2.2 Kölcsönhatás vizsgálat 8°C-on. II. erjesztési kísérlet

A két élesztőtörzs sejtjeinek kölcsönhatását egy más jellegű kísérletben is megvizsgáltam. A kölcsönhatás vizsgálatok folyamatábráját a 4.5.4 fejezetben helyeztem el. Az egyik vizsgálat (ezt

„A” módszernek neveztem el) lényege, hogy egy kevert kultúra felülúszóját hozzáadtam monokultúrás sejtekhez. Jelen esetben a kevert kultúrák 1:10, illetve 1:15 arányban tartalmaztak sörélesztőt és idegen élesztőt (33. ábra). A „B” módszerben élő Saccharomycodes ludwigii sejteket adtam hozzá Saccharomyces cerevisiae kultúrához úgy, hogy a sörélesztő:idegen élesztő arány 1:10, illetve 1:20 legyen (33. ábra). A vizsgálatok első felében – az előfermentáció során – mindkét módszernél a sörélesztők sejtkoncentrációját követtem. A második szakaszban – a főfermentációban – az „A” módszernél csak a sörélesztőt vizsgáltam (hiszen idegen élesztő már nem volt jelen), míg a „B” módszer esetében mindkét élesztő sejtszámát vizsgáltam.

„A” módszer „B” módszer 33.ábra. Sörélesztő és idegen élesztő sejtek kölcsönhatásának vizsgálata különböző

módszerekkel

Az „A” módszer arra alkalmas, hogy megállapítsuk, termel-e olyan vegyületet a kevert kultúrában az idegen élesztő, ami utána – megmaradva a tápközegben – befolyásolhatná a S. cerevisiae szaporodását. A 33. ábrán látható sejtkoncentráció változás a két vizsgálatnál azt mutatja, hogy ha az előfermentáció során nagyobb mennyiségben (1:15) volt jelen az idegen élesztő, akkor a főfermentáció során a sörélesztő nem növekedett olyan ütemben, mint a kisebb aránynál (1:10).

Korábbi kísérletekkel tisztáztam, hogy killer toxin nem állhat a jelenség hátterében, de más vegyület jelenlétét – amit a bevezetőben is említettem – nem tudtam sem igazolni, sem kizárni.

További lehetőség, hogy az előfermentáció során a tápközeg egy vagy több fontos alkotója annyira elfogyott, hogy ez akadályozta a főfermentáció során a sörélesztő szaporodását. Az erjeszthető szénhidrátok mennyiségének változását bemutató ábra a Mellékletben található (I. és II. ábra)

A „B” módszerrel azt lehet megvizsgálni, hogy az egyik sejt (ebben az esetben az idegen élesztő) jelenléte – megjelenése – a tápközegben hogyan befolyásolja a másik sejt (itt a sörélesztő) szaporodását. A főfermentáció során a S’codes ludwigii élesztő nem mutatott jelentősebb szaporodást egyik keverési aránynál sem, annak ellenére, hogy a szénhidrátok mennyisége alapján erre lett volna alkalma, mert az előfermentáció során a S. cerevisiae sörélesztő nem használta fel a glükózt és fruktózt teljes mértékben. Az idegen élesztő sejtek megjelenése a tápközegben úgy tűnik, nem befolyásolta a sörélesztő szaporodását. Ugyan a S’codes ludwigii sejtek nagyobb aránya megmaradt a kísérlet végéig, ám csökkenő mértékben. A glükózt és fruktózt ekkorra szinte teljesen felhasználták az élesztők, ám a maltózból és maltotriózból csekély mennyiség fogyott.

Elképzelhető, hogy ebben áttételesen szerepe lehet az idegen élesztőnek. A lényegesen, 10-20-szor nagyobb mennyiségű S’codes ludwigii sejtek felhasználhattak olyan tápközeg összetevőt, ami ily módon befolyásolja a másik élesztő növekedését. A Melléklet III. és IV. ábrája a szénhidrátok mennyiségének csökkenését mutatja be.

5.3.2.3 Kölcsönhatás vizsgálat 20°C-on. I. erjesztési kísérlet

Az élesztők növekedését a hőmérséklet befolyásolja. Az előző alfejezetben ismertetett kölcsönhatás vizsgálatokat megismételtem magasabb hőmérsékleten – 20°C-on – hogy a kevert kultúrák esetében megállapítsam a hőfok hatását.

SEJTKONCENTRÁCIÓK SZÉNHIDRÁT ANALÍZISEK EREDMÉNYEI

34.ábra. A sörélesztő és az idegen élesztő sejtkoncentrációjának alakulása, valamint a szénhidrátok mennyiségének változása 1:1, 1:10 és 10:1 kezdő sejtarányoknál

Az eredmények értékelése előtt azt gondoltam, hogy a magasabb hőmérséklet kedvezni fog a S. cerevisiae sörélesztőnek, mert a monokultúrás erjesztésben intenzívebb szaporodást mutatott, mint a S’codes ludwigii élesztő ezen a hőfokon.

Az eredmény az 1:1 sejtaránnyal indított erjesztés esetében megfelelt a várakozásomnak (34. ábra).

A sörélesztő és idegen élesztő sejtek aránya megközelítőleg 2:1-hez volt az erjesztés végén. A fermentáció folytatásában valószínűleg tovább is növekedett volna még a sörélesztő sejtszáma, tekintettel arra, hogy a maltózt 72 óra alatt nem használta fel maradéktalanul.

Abban az esetben, ha a S’codes ludwigii kezdő sejtszáma 10-szerese volt a sörélesztőének, a 72 órás fermentáció 48. órájában már egész kis koncentrációban volt csak kimutatható ez utóbbi. A 8°C-on tapasztaltakhoz képest az idegen élesztő szaporodása intenzívebb volt (34. ábra).

Ez alkalommal úgy is elvégeztem a vizsgálatot, hogy a sörélesztő kezdő sejtkoncentrációja volt 10-szerese az idegen élesztő kezdő sejtszámának. A sörélesztő jó ütemben szaporodott azonban – ellentétben az 1:10 kezdő sejtarányú vizsgálattal, ahol a sörélesztő a fermentáció végén nem volt kimutatható – itt a S’codes ludwigii sejtek végig jelen voltak, és ha kisebb mértékben is, de koncentrációjuk a kezdeti értékhez képest növekedett. A szénhidrát analízis szerint a 48. órára már kimerítették az élesztők a tápanyag glükóz készletét, ezért sem növekedhetett tovább a maltózt nem hasznosító idegen élesztő sejtkoncentrációja. A fermentáció utolsó 24 órájában a S. cerevisiae élesztő viszont még fel tudta használni a sörlé maradék maltóz és maltotrióz tartalmát (34. ábra).

5.3.2.4 Kölcsönhatás vizsgálat 20°C-on. II. erjesztési kísérlet

Az alacsonyabb hőmérsékleten végzett kísérletekhez hasonlóan, most is megvizsgáltam, hogy a idegen élesztő arányának növelése milyen hatással van a sörélesztőre. Ez alkalommal az „A”

módszert 1:10 és 1:30 arányú sörélesztő:idegen élesztő kevert kultúrával, míg a „B” módszert 1:30 sejtaránnyal hajtottam végre (35. ábra).

A B

35.ábra. Sörélesztő és idegen élesztő sejtek kölcsönhatásának vizsgálata különböző módszerekkel

Az „A” módszernél – aminek az eredménye arra utalhat, hogy az előfermentáció során került-e olyan vegyület a tápközegbe, ami a főfermentációban befolyásolhatja a sörélesztő növekedését – azt tapasztaltam, hogy az előfermentációban alkalmazott sejtarány hatással lehetett a S. cerevisiae szaporodására. Az előfermentáció során a glükózt és fruktózt felhasználták az élesztők, ám a maltóznak mintegy fele, a maltotrióznak egyharmada még rendelkezésére állt a sejteknek. A főfermentáció végére minden erjeszthető szénhidrát elfogyott a tápközegből, de ez a sejtszámot nem

növelte jelentősen. Az erjeszthető szénhidrátok koncentrációjának csökkenése a Melléklet V. és VI.

ábráján látható.

A „B” módszer esetében a főfermentáció során a sörélesztőhöz nagy feleslegben adott S’codes ludwigii sejtszáma nem változott, a sörélesztő azonban szaporodott. A szaporodás azonban lehetett volna intenzívebb is, ám a maltóz és maltotrióz közel fele felhasználatlanul maradt a tápközegben (Melléklet VII. ábra).