Renális I/R során észlelt nemi különbség hátterében álló mechanizmusok vizsgálata (NKA,

5.1.1.2.1 NKA

A funkcionális, szövettani és immunhisztokémiai vizsgálatokat hím és nőstény állatokon az I/R-t követőn 2 (T2) és 16 (T16) órával végeztük (328). A kontroll nőstény és hím állatok karbamid (BUN, mmol/L) és szérum kreatinin (CN, µmol/L) értékei nem különböztek. Az I/R-t 2 órával és 16 órával köveI/R-tően nősI/R-tényekben szignifikánsan alacsonyabb BUN és CN értékeket detektáltunk, mint hímekben. (T2: BUN: 7,5 ± 0,7 vs. 10,2 ± 1,0, CN: 85 ± 5 vs. 107

± 7; p<0,05 ; T16: BUN: 27,2 ± 3,6 vs. 37,2 ± 8,1; CN: 228 ± 7 vs. 276 ± 8; p<0,05). A szövettani vizsgálat megerősítette a funkcionális eltéréseket: 16 órával a stresszhatást követően nőstényekben a tubuláris nekrózis és a tubulussejt feloldódás mértéke kevésbé volt kifejezett, mint hímekben (tubuláris nekrózis: nőstény: 2,5 (2-4) vs. hím: 4,0 (4-4); tubulussejt feloldódás nőstény: 3,0 (1-4) vs. hím: 4,0 (4-4); p<0,05). Glomeruláris károsodást, intersticiális ödémát, illetve intersticiális limfocita infiltrációt egyik csoport szövetmintáiban sem észleltünk.

Az aktív NKA αα alegységének mRNS expressziójában nőstényekben közel kétszerese volt a hímekének (kontroll: nőstény vs. hím: p<0,05). T2 időpontban a különbség még kifejezettebb volt, és a szignifikáns nemi különbség még T16-ban is kimutatható maradt. Bár a T2 időpontban az αα alegység mRNS expressziója mindkét nemben jelentősen csökkent a kontroll állatokhoz képest, nőstényekben a csökkenés mértéke fele volt a hímekben észleltnek (nőstény vs. hím: p<0,05; kontroll vs. T2: p<0,05, nőstényben és hímben egyaránt).

A NKA fehérje szintjében a kontroll csoportok között nem volt nemi különbség. A NKA α1 alegység protein mennyisége T2 és T16 időpontban szignifikánsan magasabb volt nőstényekben, mint hímekben (N vs. H: p<0,05). A citoszol és sejtmembrán frakció összehasonlításakor igazoltuk, hogy több NKA fehérje került a szolubilis (inaktív) frakcióba.

A NKA enzimaktivitásának változása követte az α1 alegység fehérjeszint változásait. A két nemben eltért az enzimaktivitás változásának dinamikája is: míg nőstényekben nem volt szignifikáns változás az ionpumpa aktivitásában, addig hímekben a vizsgált periódus alatt a pumpafunkció folyamatos csökkenését tapasztaltuk (kontroll vs. T2 vs. T16: 15,89 ± 8,0 vs.

9,15 ± 2,21 U vs. 5,65 ± 3,0 U; p<0,05) (5.1/3. ábra).

5.1/3. ábra. A renális I/R károsodás hatása a NKA α1 alegység fehérje expressziójára és celluláris megoszlására.

kontroll

relatív egységrelatív egységrelatív egység

N H N H N H

kontroll

kontroll

kontroll

A NKA α1 alegységének expresszióját nőstény (N □) és hím (H ■) patkányok teljes veseszövet homogenizátumában (TOT), Triton-inszolubilis membrán (pellet=PEL) és Triton-szolubilis felülúszó (szupernatáns=SUP) frakciókban 2 órával (T2, n=6) és 16 órával (T16, n=6) az I/R-t követően. * p < 0,05 vs. H; § p < 0,05 vs. T16.

5.1.1.2.2. Hsp72

A Hsp72-t renális I/R-t követően 2, 16 és 24 órával határoztuk meg (T2,T16,T24) (329). A Hsp72 mRNS expressziója nőstényekben szignifikánsan magasabb volt már a kontroll csoportokban is, az iszkémiát követően pedig szignifikáns mértékben növekedett (kontroll vs.

T2: p<0,05). A Hsp72 protein mennyisége is szignifikánsan magasabb volt nőstényekben, mint hímekben valamennyi vizsgált csoportban (p<0,05 nőstény vs. hím).

A Hsp72 és a NKA α1 alegység között fennálló kapcsolat vizsgálatára immunfluorescens metodikát alkalmaztunk. Kontroll állatok veséjében a két fehérje a tubulussejtek bazolaterális membránján ko-lokalizálódott, és nem mutatkozott különbség a két nemben. I/R-t követően nőstényekben továbbra is jelentős mennyiségű Hsp72 és NKA α1 alegység volt detektálható a bazolateralis membrán mentén, ezzel szemben, hím állatokban mindkét fehérje esetében transzlokáció igazolódott: mindkét fehérje szinte kizárólag a citoszolban és a sejtek apikális régiójában volt detektálható. (5.1/4. ábra).

5.1/4. ábra. A Hsp72 és a NKA α1 alegység expressziójának és lokalizáiójának változása I/R-t követően a vese tubulussejtekben a két nemben.

Kékkel jelölve a sejtmag, zölddel a NKA α1 alegység, pirossal a HSP72. A ko-lokalizációt narancssárga szín jelzi (zöld és piros egymásra vetülése). A: kontroll nőstény, B: kontroll hím, C: I/R (T24) nőstény, D: I/R (T24) hím vese.

7.1.1.2.3. SGK-1 és EPO kezelés hatása

A SGK-1 expressziót I/R-t követően 2 és 24 órával határoztuk meg (T2, T24) hím és nőstény patkány vesékben (330). A hím állatokban észlelhető csökkent túlélés és súlyosabb vesekárosodás ismeretében a férfi nemi hormonhatás csökkentésének vizsgálatára a kísérleteket kasztrált hím állatokkal egészítettük ki. A SGK-1 mRNS expressziója hímekben szignifikánsan magasabb volt a nőstényekben mértekhez képest a kontroll csoportokban (p<0,05). Két órával az I/R-t követően mindkét nemben jelentősen nőtt a SGK-1 mRNS expressziója, és a növekedés hím állatok veséjében volt kifejezettebb. A T24 időpontban nőstényekben a T2 időponthoz viszonyítva változatlan, míg hímekben csökkent szintet mértünk. Kasztrált hímek veséjében mért SGK-1 mRNS és fehérje a nőstényekben észlelt szinteknek megfelelően változott I/R hatására és szignifikánsan különbözött az intakt hím állatokban mértektől (p<0,05).

Korábbi tanulmányokban igazolták, hogy a SGK-1 csökkenti az iNOS expresszióját (331).

Vizsgálatunkban az iNOS mRNS nőstényekben kontroll állapotban szignifikánsan magasabb volt mint hímekben (p<0,05). I/R-t követően mindkét nemben jelentősen nőtt a szintje, a nemi különbség azonban még kifejezettebbé vált. T24 időpontban mindkét nemben alacsony expresszió igazolódott, nemi különbség nélkül. Hím állatokban észlelt magas SGK-1 mRNS és fehérje expresszió az iNOS csökkent mRNS expressziójával társult, ezzel szemben nőstények veséjében alacsonyabb SGK-1 szint és magasabb iNOS volt kimutatható. További vizsgálatunkban igazoltuk, hogy a dexamethasone I/R protektív hatását részben az SGK-1 fehérjén keresztül fejti ki (332).

A celluláris stressz általunk alkalmazott I/R modelljén az EPO antiapoptotikus, antioxidáns és gyulladáscsökkentő hatásait vizsgáltuk (311,333). A kezelésben részesülő állatoknál humán rekombináns erythropoietin-β-ból (EPO) (Roche Magyarország) 1000 NE/tskg-ot adtunk intraperitoneálisan az I/R-t megelőzően 24 órával. A túlélést, valamint a NAK, Hsp72 és SGK-1 expressziót vizsgáltuk a korábbiakban alkalmazott modellen 2 és 24 órával (T2, T24) az inzultust követően hím és nőstény patkány vesékben.

EPO kezelés mellett jelentősen nőtt a hím állatok túlélése, ezzel szemben nőstényekben csak minimális túlélést növelő hatást észleltünk. A NKA αα alegységének és a Hsp72 fehérjének szintje a korábbiakban igazoltnak megfelelőn szignifikánsan magasabb volt nőstényekben, mint hím kontroll állatokban (p<0,05). T2 időpontban az EPO kezelés hatására nőstényekben szignifikánsan nőtt a NKA αα alegység expressziója, hímekben nem volt változás a kezelés határára. T24 időpontban kontroll nőstényekben és hím állatokban, valamint EPO kezelt nőstényekben csökkent a fehérje szintje, ezzel szemben szignifikánsan magasabb, a kiindulási értéket jelentősen meghaladó NKA αα protein expresszió volt igazolható EPO kezelt hím állatokban.

Immunfluorescens vizsgálatok szerint kontroll körülmények között a NKA αα alegység a tubulusok bazolaterális membránján helyezkedett el, Hsp72 lényegében nem volt kimutatható.

Iszkémiás inzultust követően a NKA αα megjelent a citoszolban, mely hatás hímekben volt kifejezettebb és EPO kezelés hatására jelentősen mérséklődött.

A SGK-1 szerepét hím állatokon vizsgáltuk kontroll és EPO kezelt csoportokban I/R inzultust követően. EPO kezelés valamennyi vizsgált időpontban (kontroll, T2, T24) szignifikánsan magasabb SGK-1 mRNS szinttel járt. I/R hatására 2 órával a reperfúzió után nőtt a SGK-1 expresszió, EPO kezelés mellett a szignifikánsan magasabb érték nem mutatott további növekedést. T24 időpontban csökkent az SGK-1 mRNS expresszió, de a kezelés hatására ebben az időpontban is szignifikánsan magasabb értéket regisztráltunk (p<0,05). A T24 időpontban a kezeletlen csoportban nőtt az aktív SGK-1 fehérje szintje, elérve a T2 és T24 időpontokban EPO kezelt csoportokban mért értéket.