Dohányfüst és szteroid (dexamethasone) hatása tüd ő alveoláris epitélsejtek Hsp72 rendszerére . 73

Kísérleteinket humán alveoláris epitélsejt vonalon végeztük (342). Kontroll körülmények között, 24 órás inkubációt követően a sejtek proliferáltak, átlagosan 8,55±1,1x10⁵ végső sejtszámot elérve. Dexamethasone (DEX) kezelés hatására nem tapasztaltunk szignifikáns sejtszám emelkedést. Ezzel ellentétben a dohányfüst kivonattal (CSE) kezelt sejteken a 24 órás inkubálást követően a sejtszám szignifikánsan alacsonyabb volt a kontroll csoportokhoz képest. CSE és DEX együttes alkalmazása esetén szignifikánsan, és dózis-függő módon nőtt a végső sejtszám a csak CSE-vel kezelt csoporthoz képest (5.2/1. ábra).

DEX kezelés mérsékelten növelte az apoptotikus sejtek számát a kontroll csoportokban, de statisztikailag is szignifikáns különbség csak a DEX (10) csoportban jelentkezett. A szteroid-mentes, csak CSE kezelt sejtcsoportokban az apoptózis mértéke megháromszorozódott a szteroid-mentes kontroll csoporthoz képest. DEX kezelés a CSE kezelt csoportokban szignifikánsan csökkentette az apoptotikus sejtek számát, eltörölve ezzel a különbségeket a CSE kezelt és a megfelelő kontroll csoport között a legnagyobb, DEX (10) dózisnál (5.2/2.

ábra).

5.2/1. ábra. Alveoláris epitélsejtszám változása 24 órás kontroll médium vagy cigarettafüst extraktum (CSE) alkalmazást követően, növekvő (0-szteroid-mentes, 0,1 valamint 1 és 10 µM/µL) koncentrációban adott dexamethasone (DEX) kezelés mellett.

Kontroll CSE

sejt/edény

& p<0,05 vs. 0 µM/µ DEX; # p<0,05 vs. kontroll.

5.2/2. ábra. Alveoláris epitélsejtekben apoptózis és nekrózis változása 24 órás kontroll médium vagy cigarettafüst extraktum (CSE) alkalmazást követően, növekvő (0-szteroid-mentes, 0,1 valamint 1 és 10 µM/µL) koncentrációban adott dexamethasone (DEX) kezelés mellett.

Kontroll CSE

Apoptotikus sejtarány (meghatározott egység)

& p<0,01 vs. 0 µM/µ DEX; # p<0,05 vs. kontroll.

A Hsp72 mRNS expresszió nem változott a szteroid kezelés hatására, ezzel szemben CSE alkalmazása jelentősen csökkent szinttel társult. Ezzel ellentétben a szteroid kezelés a CSE kezelt csoportokban szignifikánsan, dózisfüggően emelte a Hsp72 mRNS expresszióját (5.2/3.

ábra).

A szteroid-mentes kontroll csoportban az egyes sejtek Hsp72 fehérje expressziója alacsony volt, csakúgy, mint a Hsp72-t expresszáló sejtek aránya. A kontroll csoportokban a DEX kezelés csökkentette mind a pozitív sejtek arányát, mind az egyes sejtek Hsp72 tartalmát.

Mindegyik CSE kezelt csoportban a Hsp72 pozitív sejtek aránya szignifikánsan magasabb volt, mint a megfelelő kontroll csoportokban. Szteroid kezelés jelentősen, és dózis-függően emelte a Hsp72-t expresszáló sejtek arányát, a legnagyobb mértékben a CSE+DEX (10) csoportban, ahol a sejtek közel 80%-ában volt kimutatható a fehérje. CSE kezelés a megfelelő kontroll csoportokhoz viszonyítva szignifikánsan növelte a sejtek Hsp72 tartalmát mind a szteroid-mentes, mind a szteroiddal kezelt csoportokban. A Hsp72 pozitív sejtek átlagos Hsp72 intenzitása a CSE kezelés után az emelkedő DEX adagokkal arányosan nőtt. Az emelkedést a DEX(1) és DEX(10) csoportokban találtuk szignifikánsnak a szteroid-mentes csoporthoz képest (5.2/4. ábra).

5.2/3. ábra. Alveoláris epitélsejtek Hsp72 mRNS expresszió változása 24 órás kontroll médium vagy cigarettafüst extraktum (CSE) alkalmazást követően, növekvő (0-szteroid-mentes, 0,1 valamint 1 és 10 µM/µL) koncentrációban adott dexamethasone (DEX) kezelés mellett.

&p<0,01 vs. 0 µM/µl DEX; #p<0,05 vs. kontroll; *p<0,01 vs. 0.1 µM/µl DEX.

Kontroll

.

.

5.2/4. ábra. Hsp72 fehérjét tartalmazó alveoláris epitélsejtek aránya (a) és az egyes sejtek átlagos Hsp72 tartalma (b) 24 órás kontroll médium vagy cigarettafüst extraktum (CSE) alkalmazást követően, növekvő (0-szteroid-mentes, 0,1 valamint 1 és 10 µM/µL) koncentrációban adott dexamethasone (DEX) kezelés mellett.

Hsp72 intenzitás (meghatározott egység) Hsp72 intenzitás (meghatározott egység)

Hsp72 pozitísejtek (%)

Kontroll

Kontroll

CSE

CSE

&p<0,01 vs. 0 µM/µl DEX; #p<0,01 vs. kontroll; *p<0,01 vs. 0,1 µM/µl DEX.

Transzfekciós kísérleteink sikeresek voltak mind a szteroid-mentes kontroll, mind a CSE kezelt sejteken. A kísérletek első részében igazoltuk, hogy a legmagasabb Hsp72 expresszió a CSE+DEX (10) sejtekben mérhető, így ezt a csoportot választottuk, hogy bizonyítsuk a CSE és a szteroid kezelés együttes hatását a sejtek Hsp72 expressziójára. Míg a negatív transzfekciós kontroll (scr-RNS) nem változtatta meg a Hsp72 expressziót, a csendesítő (si)RNS-sel történő transzfekció szignifikáns – 60-80%-os - csökkenést eredményezett a fehérjeszintézis mértékében, mind kontroll, mind CSE kezelt sejtekben. Hasonlóan alakult a Hsp72-t expresszáló sejtek aránya is. A Hsp72 fehérje expressziójának csökkenésével párhuzamosan a transzfektált sejtekben az apoptózis minden csoportban szignifikánsan nőtt, bizonyítva ezzel a közvetlen kapcsolatot a celluláris Hsp72 és az apoptotikus sejthalál között (5.2/5. ábra).

5.2/5. ábra. A: Hsp72 fehérje expresszió változása Hsp72 csendesítő (si)RNS transzfekciót követően kontroll médium, cigarettafüst extraktum (CSE) és CSE+10 µM/µL dexamethasone -DEX (10)- kezelés mellett. B: Apoptózis változása Hsp72 csendesítő (si)RNS transzfekciót követően kontroll médium, cigarettafüst extraktum (CSE) és CSE+10 µM/µL dexamethasone – DEX(10)-kezelés mellett.

A

B

Kontroll

Kontroll

Kontroll

K K

K

Kezelési csoport

Kezelési csoport Kezelési csoport

Hsp72 pozitív sejtek aránya Meghatásozott egység) Hsp72 intenzitás (meghatáozottegység)

Apoptotikus sejtek aránya Meghatásozott egység)

A: &p<0,01 vs. CSE, #p<0,05 vs. szteroid kezelésben nem részesült kontroll (C); *p<0,01 vs. kontroll, p<0,01 vs.

scrRNS (transzfekciós kontroll RNS).

B: &p<0,01 vs. CSE, #p<0,05 vs. szteroid kezelésben nem részesült kontroll (C); *p<0,01 vs. kontroll, p<0,01 vs.

scrRNS (transzfekciós kontroll RNS).

5.3. Klinikai vizsgálatok

5.3.1. Transzplantációt követően a krónikus graftműködést befolyásoló faktorok

Tüdőtranszplantáció után az első évben jelentősen nő az infekciók rizikója. Magyarországon a disszertáció megírásakor a tüdőtranszplantációt a Medizinische Universität Wien Mellkassebészeti osztálya végezte magyar tüdőbetegek részére. A Semmelweis Egyetem Pulmonológiai Klinikáján 2008 októbere óta végezzük a betegek utógondozását. Munkánkban az első 12 esetnél a légúti kórokozók spektrumát analizáltuk. Vizsgálatunkban az első posztoperatív évben igazolt infekciókat összegeztük a legalább 6 hónapja szervátültetésen átesett pácienseknél (343). A betegek klinikai adatait a 12. táblázat összesíti. Az első három hónapban a műtétet követően leggyakrabban Pseudomonas törzset igazoltunk a légutakból, melynek hátterében a CF-s recipiensek nagy száma állt, akiknél már a műtét előtt is igazolható Pseudomonas kolonizáció. A 3-6. hónapban Pseudomonas csak CF-es páciensekben volt kimutatható, Candida fajokat COPD miatt transzplantáltakban azonosítottunk. Gyakori volt még az Aspergillus infekció és 2 esetben igazolódott CMV fertőzés (5.3/1. ábra).

12. táblázat. Tüdőtranszplantált betegek demográfiai jellemzői.

Transzplantáció óta eltelt idő (hónap) 10,33±3,11 (4,5-12) Immunszuppresszió n (%)

5.3/1. ábra. Légúti patogének a tüdőtranszplantációt követő első 12 hónapban.

1-3 hónap 3-6 hónap 6-12 hónap

Észlelt patogénekszáma