Receptor internalizáció mérése CB 1 -pozitív interneuron terminálisokban . 102

A ligandkötéssel aktivált GPCR jelátvitelt a receptor internalizációja követi (Moore és mtsai., 2007). Ilyenkor a receptor clathrin-mediálta endocitózis folyamattal eltűnik a plazmamembránból, majd újrahasznosul vagy lebontásra kerül. A CB1 receptor, ami az agyban az egyik leggyakoribb GPCR (Herkenham és mtsai., 1990), ligandkötés hatására szintén internalizálódik (Coutts és mtsai., 2001; Hsieh és mtsai., 1999). Hogy mérni tudjuk az internalizáció mértékét egy újabb analízis funkciót építettünk a VividSTORM-ba, az internalizációs index (II) számítást. Az II számításnak kétféle módját valósítottuk meg. Az egyik esetben a lokalizációs ponthalmazra 2D konvex burkolót feszítünk (a Z koordinátákat figyelmen kívül hagyjuk), amelynek meghatározzuk a területét és kiszámítjuk azt az r sugarat, ami egy ilyen területű körhöz tartozik. Meghatározzuk a lokalizációs ponthalmaz 3D M tömegközéppontját és, kiszámítjuk d-t, ami az euklidészi távolság az M és az LP (lokalizációs pont) között. A minden LP-re kiszámított d/r értékeket átlagoljuk, így kapjuk az II-t, melynek értéke 1 körüli, ha minden LP a plazmamembránon van, és 0, ha a tömegközéppontban. A II számítás egy másik lehetősége, hogy konvex burkolót feszítünk a membránt jelölő LP halmazra, majd megmérjük a receptort jelölő LP-k euklidészi távolságát ettől a felszíntől. Minden LP-t internalizáltnak tekintünk, amely a konvex buroktól nagyobb távolságra van, mint egy megadható küszöbérték. Végül az II értékét a membránban lévő LP-k és az internalizált LP-k számának hányadosa adja meg.

Kísérleteink során az exogén és az endokannabinoidok internalizációt okozó hatását is teszteltük ezzel az elemzéssel. Először a két legfontosabbnak tartott

103

endokannabinoid, a 2-AG és az anandamid hatását vizsgáltuk. Egér hippokampális túlélő agyszeleteket JZL184-el (JZL) és PF3845-el (PF) kezeltünk, amelyek gátlói a 2-AG, illetve az anandamid lebontó enzimeinek. A gátlószerek hatására mind a két endokannabinoid szintje több, mint kétszeresére emelkedik a szövetben. Érdekes módon sem a LP-k számában sem pedig az internalizációs indexben nem tapasztaltunk változást a megnövekedett 2-AG, illetve anandamid szint hatására. A külső kannabinoidok internalizációs hatásának tesztelésére egereket hat napon keresztül hasüregbe adott THC (Δ⁹-tetrahydrocannabinol)-tartalmú injekciókkal kezeltünk, olyan testtömeg arányos dózisban, amelynek eredményeképpen az egerek vérében a THC koncentráció megfelel egy rekreációs célból marihuánát szívó ember vérében mérhető THC szintjének. Ebben a krónikus kezelési modellben már drasztikusan kimutatható volt a CB1 receptorok számának csökkenése. STORM méréseinkben 74%-kal kevesebb LP-t találtunk a periszomatikus boutonokon, mint a kontroll esetben és az internalizációs indexben is szignifikáns változást lehetett mérni (Dudok és mtsai., 2015, 6. ábra). Az STORM képalkotás és az internalizációs index analízis tehát nanoskálájú pontossággal mutatja meg a kannabinoidok hatását a CB1 internalizációjára és ez a molekuláris tolerancia jelenség feltehetően hátterében állhat a hasonló dózisok esetében tapasztalható viselkedési toleranciának.

4.3.9. A STORM képalkotás kiterjesztése további szövettípusokra

Munkánk során a STORM képalkotást leginkább idegszöveten vagy sejtkultúrán végeztük. Célunk azonban egy általános, az élettudományok minden területén hasznos mikroszkópos képalkotási és adatelemzési megközelítés kifejlesztése volt. Ezért az utolsó lépésben megvizsgáltuk, hogy az alkalmazott minta előkészítési és képalkotási protokollunk más szövettípusokban is ugyanilyen jól alkalmazhatóak-e. Mivel a STORM képalkotás igényel néhány speciális feltételt, mint például nagy képalkotási lézerintenzitás, különleges képalkotási lefedő médium, fedőlemezre szárított metszetek, ezért előfordulhat, hogy más szövettípusok máshogyan viselkednek ilyen körülmények között. Olyan jelölést választottunk, amely minden szövettípusban jelen van, a sűrűsége megfelelően nagy ahhoz, hogy a struktúrát helyesen mintavételezze (Nyqiust) és megfelelő minőségű antitest is rendelkezésre áll.

104

34. ábra Korrelatív konfokális és STORM képalkotás különböző szövetekben és jelölésekkel. (a-b) Embrionális radiál glia EGFP-vel transzfektálva és mitokondrium (TOM20) STORM.(c-d) Szívizom falloidin festés (konfokális) és TOM20 STORM. (e-f) Vese kéregállományban parvalbumin, falloidin, TOM20 konfokális és TOM20 STORM jelölés.

105

A választásunk így a TOM20-re esett, ami egy mitokondriális külső membránban elhelyezkedő fehérje. Az egyedi vagy sejttípus-specifikus jelölés egyik módja az általunk is követett patch-pipettával történő egyedi sejtfeltöltés. Ezenkívül mások mellett gyakori a vírusos jelölés vagy az in utero elektroporációs genetikai jelölés is. Az első mintánkban in utero, elektroporációval transzfektáltunk EGFP-t radiális gliasejt progenitorokba. A fixált embrionális szövetet a CB1 esetében használt protokoll szerint jelöltük. A második mintánk egér szívizom volt, amelyben az AF647-el jelölt TOM20 STORM képalkotást falloidin konfokális jelöléssel kombináltuk a mitokondriumok megfigyelésére a szívizomsejtek (kardiomiociták) szarkomerjeiben. A harmadik szöveti tesztfestésnél veseállományban kombináltunk két konfokális és egy STORM modalitású immunfestést.

A szöveti struktútát falloidinnel jelöltük és parvalbumin-immunfestéssel láthatóvá tettük a nefronok disztális csatornáinak egyedi sejtjeit. A kísérletben a dekonvolvált konfokális modalitás alapján elkülöníthetőek voltak a PV+ epithél sejtekhez tartozó, de már a STORM szuperfelbontású csatornában láthatóvá tett mitokondriumok (34. ábra). A különböző szöveteken, különböző jelölési eljárásokkal (egyedi sejt feltöltése, plazmiddal transzfektálás, immunfestés neurokémiai markerrel), de ugyanazzal a minta előkészítési protokollal készült korrelatív konfokális és STORM szuperfelbontású képek alapján elmondható, hogy a dolgozatban bemutatott mintakészítési, képfelvételi és elemzési módszer általánosan használható megközelítések lehetnek az élettudományi kutatásokban.

106