4. EREDMÉNYEK
4.1. A STORM mikroszkópos képalkotás optimalizálása sejtkultúrában és idegszövet
4.1.5. A STORM képalkotási paraméterek optimalizálása agyszövet esetében
Az egyedi molekula lokalizációs módszerek szinte mind egyszerű EPI fluoreszcens mikroszkópot használnak. A mintát lézerrel világítjuk meg, a fluoreszcencia érzékelése pedig EMCCD vagy sCMOS kamerákkal történik. A teljes látótér kivilágítása leginkább a TIRF mikroszkópok esetében használt optikával valósul meg. Mint minden képalkotási technikában, tapasztalatunk szerint a STORM esetében is jelentős hangsúlyt kell fektetni a megfelelő képalkotási paraméterek megválasztására, amelyek között speciálisan az erre a módszerre jellemzőek is megtalálhatóak. A megvilágítás intenzitásának optimalizálásához először is figyelembe kell venni a fluoreszcens jelölő anyag fotokémiai tulajdonságait. Az AF647 esetén a kivilágítás intenzitása kevéssé befolyásolja az egy bekapcsolásra eső foton számot. Viszont nagyobb teljesítménynél az aktív ciklusidő (duty cycle) hamarabb eléri a kívánatos alacsony értéket és a nagyobb végleges fakulási arány miatt egy AF647 festék kevesebbszer villan fel (Dempsey és mtsai., 2011). Az AF647 ilyen viselkedése miatt méréseink alapján a kivilágítást érdemes a lehető legnagyobb
72
teljesítményre állítani (2-10 kW/cm2). A detekciós oldalon szintén több paraméteres az optimalizációs tér. A Nikon N-STORM mikroszkópon mi Andor iXon Ultra 897 EMCCD kamerát használtunk. Az EMCCD kamerák előnye, hogy még a kiolvasás előtt lehet erősíteni a jelet (EM gain), így a kiolvasási zaj nem erősödik, jobb lesz a Jel/Zaj arány más rendszerű kamerákhoz képest. A legjobb Jel/Zaj arány érdekében tapasztalataink szerint az EM gain-t 300-ra, a PreAmp gain-t pedig 2,4x-re érdemes állítani. Ennek a kameratípusnak további előnye, hogy úgynevezett hátsó megvilágítású érzékelő lapocskát használ, ami a kamera kvantumhatásfokát növeli jelentősen (90%, 700 nm hullámhossznál). Az expozíciós idő alapvetően a festékek aktív ciklusidejétől függ. Ha nagyon hosszú az expozíciós idő (>300 ms), akkor nagy eséllyel kapunk egy-egy képen átfedő pontátviteli függvényeket ('végtelen' expozíciós idő esetén hagyományos EPI fluoreszcens képet kapunk vissza). Ha az expozíciós időt nagyon alacsonyra választjuk (<16 ms), akkor pedig egy felvillanás több képen is megjelenik. Ilyenkor meg kell vizsgálnunk, hogy vajon ugyan az a felvillanás tart-e több képsorozaton keresztül, vagy az már egy másik, független felvillanás. Ráadásul a külön pixelkiolvasások miatt a Jel/Zaj arány is csökken. Szisztematikus méréseink alapján az AF647 esetében 30 ms expozíciós idő az optimális.
A TIRF kivilágítási rendszernek köszönhetően a megvilágítás szöge változtatható.
A döntött kivilágítás előnye, hogy egészen ferde szögeknél (a kivilágításnak az objektív optikai tengelyétől nagy szögeltérésnél) a minta egyre vékonyabb szeletét éri csak a gerjesztő fény, így a fókuszon kívüli mélységekből származó elmosódott kép kevésbé rontja a Jel/Zaj arányt. Számos felhasználói tapasztalat után kiderült, hogy az ideális kivilágítási szöget mintáról-mintára és mélységről-mélységre be kellett állítani. Egyes egyedi építésű rendszereknél megvalósított HILO kivilágítás még alkalmasabb a Z irányú megvilágítás vékonyítására (Tokunaga és mtsai., 2008). Az eddigi beállítások az egyedi PSF képének optimális felvételére vonatkoztak. A STORM képalkotás során természetesen egy látótérben nem egy PSF jelenik meg a legtöbb esetben, hanem mintától függően akár több száz is előfordulhat. Tapasztalataink szerint nagyon fontos, hogy mindig egyensúlyt kell tartani az egy képen megjelenő felvillanások száma és az ezek közül egymással átfedő PSF-űek száma között.
73
17. ábra A STORM képalkotás paramétereinek optimalizálási lépései idegszövet preparátumban. (a) AF405 - AF647 aktivátor-riporterrel jelölt CB1 immunfestés egér hippokampusz metszetben. A mintákat a legerősebb 647 nm-es lézerrel folyamatosan világítottuk meg. Minden képen 1,5-es gamma korrekció van. A képek (bal) és a belőlük nagyított egyetlen lokalizációk (jobb) különböző (TIRF optikával beállított) szögű gerjesztő megvilágítás mellett láthatóak (fentről lefele). A megfelelő szögbeállítás mellett alacsony háttér és a PSF nagy csúcsmagassága érhető el.
74
Ha nagyon kevés a felvillanás, akkor az átlapolás valószínűtlen, kevesebb lesz az analízis során elvesztett lokalizációk aránya, de lassabb lesz a képalkotás. Ha viszont túl sok felvillanás jelenik meg egy képen, akkor akár minden PFS átfedhet egy szomszédossal, így lehetetlenné válik a Gauss-illesztés. Mind az aktivátor-riporter, mind pedig a dSTORM megközelítésben bizonyos mértékig befolyásolni tudjuk a felvillanások sűrűséget a megfelelő aktivátor megvilágítással (Bates és mtsai., 2007). Az AF647 esetében a 405 nm-es megvilágítás elősegíti a fluorofór bekapcsolt állapotának létrejöttét a kikapcsolt állapotban bekövetkező UV abszorpciós hatáskeresztmetszet növekedéssel (Dempsey és mtsai., 2009b; van de Linde és mtsai., 2011; Vogelsang és mtsai., 2008). Az optimális aktivátor megvilágításnál tehát maximalizálnunk kellett a képenkénti, Gauss-illesztésre alkalmas PSF-ek számát. A mintában a fakulás miatt a fluorofórok száma egyre csökkent, így ha a képenkénti felvillanás számot (NLP) állandó értéken akartuk tartani, akkor az aktivátor lézer intenzitását folyamatosan növelnünk kellett. A STORM képalkotás megvilágítási és érzékelési oldalon is sokféle értékkel befolyásolható, az egyes paramétereknek nagy hatása van a Jel/Zaj arányra és a képfelvételi sebességre. A biológiailag érdekes vizsgálatok alapfeltételeként sikerült a STORM képalkotási paramétereket optimalizálnunk agyszövetben (17. ábra).
(b) A záridő, EM erősítés és az előerősítés (PreAmp gain) az (a) pontban beállított szögnél optimalizálva. (c) STORM képalkotás egy még meg nem világított területen a megfelelő lokalizációs pontsűrűség beállítására. Egy 405 nm-es aktivációs megvilágítási kép (nem látható) után három 647 nm-es gerjesztő kép látható (balról jobbra). Fentről lefelé látszik a különböző százalékban kifejezett aktivátor intenzitások hatása a lokalizációs pontok számára (sűrűségére). Az optimális 1%-nál a PSF-ok száma magas, de kevés az átlapoló közöttük. (d) Egy harmadik még meg nem világított terület 10 perces (20.000 képkocka) STORM képalkotásának egyes adatai az (a-c) -ben optimalizált paraméterek mellett. Az üres fekete karikák a 100 képenkénti lokalizációs pontok (NLP) számát mutatják az idő függvényében, az összesített NLP-t a piros szaggatott vonal jelzi, míg a eltelt időre eső összesített NPL-k szürke szaggatott vonallal látszanak. A képenkénti NLP 50%-ra csökken 3000 kép után (90 másodperc).
75