4. EREDMÉNYEK
4.2. Korrelatív konfokális és egyedi molekula lokalizációs szuperfelbon-tású
4.2.1. A korrelatív konfokális és egyedi molekula lokalizációs mikrosz-kóp felépítése
A mikroszkópos felvételek felbontásának meghatározására két szempontot érdemes figyelembe venni. Az egyik szempont az előző fejezetben tárgyalt lokalizációs pontosság, azaz az egyedi jelölőanyagok pozícióját milyen pontosan tudjuk meghatározni.
82
A másik szempont pedig az, hogy az adott jelölésünk milyen sűrűségben fordul elő a megfigyelni kívánt struktúrán. Egy-egy fehérje helyzetét például az egyedi molekula lokalizációs mikroszkópiák (STORM/PALM) akár néhány nanométeres pontossággal 21. ábra Lokalizációs pontosság és NLP számok függése néhány fontos paramétertől. (a) A laterális lokalizációs pontosság kis mértékben függ csak a mintabeli mélységtől. (b-c) A képalkotó lézer intenzitásának növelésével növekszik a lokalizációs pontok száma és lokalizációs pontosság (minden intenzitás esetében ugyanazon paraméterek mellett három képet vettünk fel). (d) Az aktivátor lézer hatásának vizsgálatához CB1 és homer fehérjéket jelöltünk aktivátor-riporter (AF405-AF647) festékkel. A lokalizációs pontosság csökken az aktivátor intenzitásának emelésével a megemelkedett háttér és az egyre inkább átfedő csúcsok miatt.(e) Az összes lokalizáció száma nem változik az aktivátor teljesítményének változtatásával, mert a kezdeti nagyobb jelszám gyorsabban is csökken (aktivátor 405nm lézer intenzitás 0.3, 0.8 illetve 3.2%).
(f) A Z koordináták gyakoriság eloszlása jól mutatja a csökkenő detektálási valószínűséget a fókuszsíktól távolodva. Az eloszlás aszimmetrikus a fókuszsík alatti és feletti szférikus aberráció eltérése miatt.
83
megadhatják. Ha azonban például a sejt membránjait szeretnénk láthatóvá tenni, akkor olyan sűrűségű jelölést kell választani, amire igaz az, hogy a jelölőanyagok közötti legkisebb távolság a fele legyen a membránban előforduló legkisebb struktúráknak (pl.
invaginációk, vezikulák).
A korábbi nanoskálájú molekuláris képalkotásra használt immunarany jelölésen és elektronmikroszkópián alapuló eljárásokban például az ozmium-tetroxid kötődik a membránokhoz és szinte kitölti azokat ezzel szubcelluláris kontextusba helyezi a kolloidális arany szemcse által reprezentált molekuláris jelet. A fénymikroszkópos képalkotás esetében is léteznek specifikus lipofil membránfestékek (DiI, Dio, MitoTracker stb). Habár a STORM képalkotás esetében nagy segítség lenne egy jó villogási paraméterekkel rendelkező, az AF647-től spektrálisan különböző 22. ábra Elektrofiziológiai folt-zár mérőrendszer és a konfokális-STORM mikrosz-kóp. A DIC képen éppen egy interneuront közelít meg a folt pipetta. A STORM képen egy töltött axonszakasz látszik boutonokkal. A CB1 receptort AF 647-el vizualizáltuk és zöld színnel jelenítettük meg.
84
membránspecifikus festék és egyes irodalmi adatok szerint a Di festékcsalád elemei akár alkalmasak is lehetnek (Shim és mtsai., 2012), de saját kísérleteink nem vezettek eredményre. Tapasztalataink szerint valószínűleg a szövetben a lipofil festék fixálásával kapcsolatos technikai nehézségek miatt idegszövetben ez a megközelítés még nem megoldható. Ezért úgy döntöttünk, hogy egy hagyományos konfokális szintű felbontású képet megpróbáljuk ötvözni a STORM képalkotással. Ennek elérésére az eredeti Nikon N-STORM mikroszkópunkat egy C2-es konfokális fejjel szereltük fel a korrelatív konfokális-STORM képalkotáshoz (22. ábra).Ez lehetővé teszi, hogy egy adott sejttípust és adott szubcelluláris kompartmentumait a megfelelő neurokémiai marker immunfestésével megjelenítsük, majd a konfokális mikroszkóppal azonosított célprofilokon belül STORM képalkotással a célmolekula térbeli eloszlását feltérképezzük. A fenti megközelítés alkalmas ugyan populációs szintű vizsgálatokra, azonban nem alkalmas az élettani, morfológiai és molekuláris adatok begyűjtésére ugyanabból a célsejtből vagy célprofilból. Az élettani, anatómiai és molekuláris mérések kombinálásának lehetősége miatt ezért mi a doktori munkám során egy másik, úgynevezett egyedi sejtjelölésen alapuló eljárás kidolgozására fektettünk nagyobb hangsúlyt. A méréssorozat felépítése a következő főbb módszertani lépésekből áll (23.
ábra):
1) In vitro teljes-sejt patch-clamp elektrofiziológiai mérések akut, túlélő, egér hippokampális szeleteken. Az élettani karakterizáció közben az egyedi célsejt feltöltése biocitinnel.
2) A szelet fixálása és a biocitin jelölés előhívása AF488-sztreptavidinnel, a célsejt vizualizálására, DAPI festés a sejtmagok megjelenítésére és a réteghatárok kijelölésére.
3) A lefedett szeletben a töltött sejtről konfokális Z-sorozat felvétele morfológiai rekonstrukcióhoz és sejttípus azonosításhoz.
4) A 300 µm vastag akut élettani szelet továbbmetszése 20 µm vastag hippokampusz metszetekre.
5) A 20 µm vastag metszetek szabadon lebegő immunfestése. Fedőlemezre szárítás.
6) STORM és konfokális képalkotás.
85 7) A képek megjelenítése és az adatok elemzése.
4.2.2. A korrelatív konfokális és STORM képalkotás
A STORM mikroszkópos képalkotás előtt a fedőlemezre szárított 20 µm vastag metszeteket képalkotási lefedő médiummal egy tárgylemezre raktuk, majd áttetsző körömlakkal rögzítettük. Nagyon fontosnak bizonyult, hogy a mérés előtt a körömlakk tökéletesen megszáradjon.
23. ábra Mintakészítési és képalkotási folyamat a korrelatív elektrofiziológiai és konfokális-STORM képalkotás során. (a-c) Akut túlélő 300µm vastag hippokampális szelet készítés. (d) Elektrofiziológiai mérések, sejtfeltöltés biocitinnel. (e) A szelet rögzítése, a biocitin jelölés előhívása. (f) A teljes sejt képének konfokális Z-sorozat felvétele. (g) A szelet beágyazása és 20µm-es metszetek készítése. (h) Immunfestés. (i) A metszetek fedőlemezre húzása és rászárítása. (j) Közvetlen a képalkotás előtt STORM lefedőközeg alkalmazása. (k) Korrelatív konfokális-STORM képalkotás.
86
24. ábra Korrelatív konfokális és STORM képalkotás. (a) Biocitinnel töltött axonszakasz dekonvolvált konfokális képalkotással megjelenítve. (b) Ugyanazon látótérben a CB1 receptor AF405/AF647 aktivátor-riporter immunfestéssel Gauss reprezentációban látszik. (c) Az (a) és (b) képek egymásra illesztve. (d) Az (a) képen fehér négyzettel jelölt terület CB1 festésének nagy nagyítású STORM képe. (e) A (d) kép alatt látszik a biocitin konfokális jel is.
87
Száradás közben ugyanis kis mértékben mozgatja a fedőlemezt a tárgylemezhez képest, így csúszást visz a képbe, ami ebben a felbontásban már jól látható, felbontás vesztést és műtermékeket okozhat. A metszetről első lépésben súrló kivilágításban áteső mozaik felvételt készítettünk 10x-es objektívvel. Ez a kép szolgált az agyszövetben tájékozódásul a 100x-os objektíves képalkotásnál. A 20x-os objektívvel már meghatározható az a terület, ahol a töltött sejt axonfája található. A 100xTIRF NA1,49 olajos objektívvel 488 nm-es epifluoreszcens kivilágításban a boutonokat megkerestük, majd konfokális képet készítettünk róla a C2 fejjel zöld (AF488) és távoli vörös (AF647) csatornákban. A CB1
STORM képalkotást 647 nm-es megvilágítással és 405 nm-es aktivátor lézer használatával végeztük. A dekonvolvált konfokális Z-sorozat felvételből a megfelelő síkot összeillesztettük a Nikon NIS-Elements programcsomag N-STORM modulja által létrehozott STORM képpel (24. ábra).