MDA mérése

A köpetfelülúszók és az EBC minták MDA koncentrációját a Lärstad és mtsai. által kidolgozott módszer szerint [245] izokratikus HPLC technikával határoztuk meg. A mérésekhez 25 µL EBC-t vagy köpetmintát használtunk fel, a forgalmazó cég ajánlásait követve (MDA Reagens Kit, Chromsystems Ltd., München, Németország). A méréseket fluoreszcens detektorral felszerelt HPLC készülékkel (Jasco FP-2020 Plus, ABL&E-Jasco Ltd., Budapest, Magyarország) végeztük, az elválasztásra MDA HPLC-oszlopot (Chromsystems) használtunk. A mérések 1.0 mL/min áramlási sebesség mellett 515 nm excitációs, illetve 553 nm emissziós hullámhosszokon történtek. Egy méréshez 20µL minta került felvitelre. A kit méréshatára 0.01 µmol/L volt.

110 A köpetindukciónak az MDA szintre gyakorolt közvetlen hatását előkísérletben tanulmányoztuk, mégpedig stabil COPD-s betegek egy csoportjának (n=10) indukált és spontán köpetmintáin. Vizsgálati eredményként az MDA koncentrációja az indukált és a spontán köpetmintákban hasonlónak bizonyult (135.7±9.7 vs. 148.1±7.3 nmol/L, p>0.05). A mérés visszamérhetőségi koefficiense 48.7 nmol/L, egyezési tartománya –30.8 és 55.7 volt.

24. táblázat

A vizsgálatot befejezett betegek légzésfunkciós, FENO és vérgáz adatai Kontroll vitálkapacitás, FEV1: forszírozott kilégzési térfogat 1 másodperc alatt, FENO: frakcionált kilégzett nitrogén-monoxid, ppb: részecske per milliárd, PaCO2: parciális szén-dioxid nyomás, PaO2: parciális oxigén nyomás. ^§medián (interkvartilis tartomány), ^*p<0.05 stabil COPD vs. kontroll, ^**p<0.001 stabil COPD vs. kontroll, ^#p<0.05 exacerbáció vs. kezelés után, ^##p<0.001 exacerbáció vs. kezelés után 5.7.6. MDA-mérések intra- és inter-assay reprodukálhatósága

Az MDA mérések intra-assay reprodukálhatóságának meghatározásához a már megmért EBC (n=12) és köpetminták (n=12) egy csoportját 4°C-on tároltuk két héten át, majd ismételten lemértük. Az MDA mérések inter-assay reprodukálhatóságának meghatározásához stabil COPD-s beteg egy csoportjának (n=12) köpet és EBC mintáit közvetlenül a gyűjtés után kettéosztottuk, majd a mintákat külön-külön dolgoztuk fel és mértük meg.

111 5.7.7. MDA-mérések napok-közötti variabilitása

Az MDA mérések napok-közötti variabilitásának meghatározásához stabil COPD-s betegek egy csoportjától (n=12) két egymást követő napon EBC és spontán köpetmintákat gyűjtöttünk, és az ugyanazon betegektől származó mintákat külön-külön feldogoztuk és mértük.

5.7.8. Statisztikai analízis

Az adatok átlag±SEM vagy medián (interkvartilis tartomány) formában szerepelnek. Az adatok eloszlását a Kolmogorov–Smirnov teszttel vizsgáltuk. Az MDA koncentráció értékeket egyutas ANOVA-t követő Newman–Keuls teszttel elemeztük. A kórházi felvételkor és a távozáskor mért adatokat párosított a Student-féle t-próbával (parametrikus adatok) vagy a Wilcoxon előjeles rang-próbával (nem parametrikus adatok) hasonlítottuk össze. A stabil COPD-s betegek és az egészséges önkéntesek alapvonali adatait párosítatlan t-teszttel, illetve a Mann–Whitney teszttel hasonlítottuk össze. A korrelációs koefficienseket a Pearson-módszer szerint számoltuk. Az MDA mérések reprodukálhatóságát és variabilitását a variációs koefficiens és a Bland–Altman teszt segítségével határoztuk meg. A visszaméréseknél meghatároztuk a reprodukálhatósági koefficienst is [262]. A számításokat a GraphPad Prism (GraphPad Software Inc.) statisztikai programmal végeztük. A különbségeket p<0.05 esetén tekintettük szignifikánsnak.

5.7.9. Eredmények

A vizsgálat során 54 betegből 44-nél teljesültek a beválasztási kritériumok. A kórházi kezelés során 10 beteg került kizárásra, így végezetül a vizsgálat 34 beteg részvételével fejeződhetett be (40. ábra).

A kórházi kezelés során minden beteg szisztémás (i.v. vagy per os) szteroid lökéskezelésben részesült, amelyet rövid-hatású hörgtágítókkal (2-agonista és/vagy antikolinergikum) egészítettünk ki. A betegek 73%-a hosszú-hatású hörgtágítókra (₂ -agonista vagy antikolinergikum), valamint 89%-uk oxigénterápiára is szorult. Antibiotikum terápiában 19 beteg részesült. Az átlagos ápolási idő 10.9±1.5 nap volt.

A kórházi kezelés után a betegek klinikai állapota javult, a légzésfunkciós paraméterek és a betegek PaO₂ értéke szignifikánsan nőtt, a FENO értékek pedig szignifikánsan

112 csökkentek (24. táblázat). A betegek gyógyulásával párhuzamosan a köpet neutrophilsejtszáma csökkent (25. táblázat). A gyulladásos sejtek százalékos megoszlása a köpetben ugyanakkor hasonló volt a kórházi felvételkor és távozáskor.

25. táblázat

A vizsgálatot befejezett betegek köpet sejtprofil adatai

Kontroll Stabil COPD COPD exacerbáció exacerbáció kezelés után Az adatok medián (interkvartilis tartomány) formában szerepelnek. ^*p<0.05 stabil COPD vs. kontroll,

#p<0.05 exacerbáció vs. kezelés után, ^§p<0.01 exacerbáció vs. kezelés után

Az MDA-mérések intra- és inter-assay, valamint napok-közötti reprodukálhatóságára vonatkozó adatait a 26. táblázatban foglaltuk össze. Az intra- és inter-assay reprodukálhatóság meghatározásakor a variációs koefficiens és az egyezési tartományok hasonlóak voltak a köpetben és az EBC-ben. Az intra-assay reprodukálhatósági koefficiens a köpetben 25.7, míg az EBC-ben 18.5 nmol/L volt. Az inter-assay reprodukálhatósági koefficienst a köpetben 54.9, míg az EBC-ben 34.0 nmol/L-nek mértük.

Az MDA-mérések napok-közötti reprodukálhatósága az EBC-ben jóval gyengébb volt, mint a köpetben (26. táblázat). Köpetben a két mérés közötti átlagos különbség 15.5 nmol/L volt, amely érték az EBC-ben 30.9 nmol/L-re nőtt. A variációs koefficiens értéke az EBC-ben szignifikánsan nagyobb volt, mint a köpetben. Hasonlóan, az egyezési tartományok is szélesebbek voltak az EBC-ben, mint a köpetben. A reprodukálhatósági koefficienst a köpetben 43.2, míg az EBC-ben 75.1 nmol/L-nek mértük.

113 26. táblázat

Az MDA-mérések reprodukálhatósága a köpet és az EBC mintákban MDA mérések (nmol/L) Variációs Az adatok átlag±SEM formában szerepelnek, kivéve, ha ezt másképp jelöltük. ^*p<0.05 EBC vs. köpet,

#Bland-Altman teszt alapján

41. ábra. A légúti minták MDA koncentrációja a különböző vizsgálati csoportokban A köpet („a” panel) és az EBC („b” panel) MDA koncentrációja egészségesekben, stabil COPD-s betegekben, valamint akut exacerbációban lévő COPD-s betegekben kórházi felvételkor (ex) és kezelés után (kezelt). A vízszintes vonal az átlagértéket jelzi. ^*p<0.05 stabil beteg vs. egészséges kontroll, ^**p<0.01 exacerbációban lévő vs. stabil beteg, ^***p<0.001 exacerbációban lévő beteg vs.

egészséges kontroll, ^§p<0.05 kezelt vs. stabil beteg ^#p<0.05 exacerbáció vs. kezelés után

A köpet MDA koncentrációja a stabil COPD-s betegekben szignifikánsan magasabb volt az egészséges kontroll csoporthoz képest (144.6±14.3 nmol/L vs. 85.9±11.3 nmol/L, p<0.05; 41.

ábra). Az exacerbációban lévő betegekben a köpet MDA koncentrációja tovább emelkedett (220.0±17.5 nmol/L, p<0.01), majd a kezelés után csökkent (190.7±16.3 nmol/L, p<0.05).

114 A továbbiakban a köpet MDA koncentrációjának és a betegek funkcionális válaszkészségének kapcsolatát elemeztük. Ennek során az exacerbációban lévő betegeket tercilisekre osztottuk a kezelés során elért FEV1-növekedés (FEV1) szempontjából.

Kimutattuk, hogy a felső és a középső tercilisbe tartozó betegekben a kezelés során a köpet MDA szintje szignifikánsan csökkent (p<0.05), míg az alsó tercilisbe tartozó betegekben a marker koncentrációja nem változott a hospitalizáció ideje alatt (p>0.05; 42. ábra).

Az EBC MDA koncentrációja a stabil (96.1±11.6 nmol/L) és az exacerbációban lévő betegekben (93.3±7.6 nmol/L), valamint az egészséges önkéntesekben (73.1±5.1 nmol/L) hasonló volt (p>0.05; 41. ábra). Az exacerbáció kezelése nem befolyásolta az EBC MDA szintjét (85.3±7.1 nmol/L, p>0.05).

Az EBC és a köpet MDA koncentrációja, a FENO szintek, a légzésfunkciós és a vérgáz értékek, valamint a köpet sejtprofilja (összes és differenciált) között szignifikáns korrelációt egyik vizsgálati csoportban sem találtunk (adatokat nem mutatjuk).

42. ábra. A köpet MDA koncentráció-változásának és az exacerbációban lévő betegek funkcionális válaszkészségének kapcsolata

A köpet MDA koncentrációjának individuális változásai akut exacerbációban lévő COPD-s betegekben kórházi felvételkor (ex), majd kezelés után (kezelt). A betegeket a kezelés során elért és százalékban („a” panel) vagy literben mért („b” panel) FEV1-növekedés (FEV1) alapján tercilisekre osztottuk fel. A vízszintes vonal az átlagértéket jelzi. ^*p<0.05 exacerbáció vs. kezelés után

5.8. Eikozanoidok vizsgálata krónikus obstruktív tüdőbetegségben szenvedő betegek köpetében