KP1019 és KP1339 kölcsönhatása humán szérum albuminnal

A klinikai vizsgálatokba jutott KP1339 és a KP1019 (2. ábra) ruténium(III)-tartalmú bisz-indazol komplexek HSA-hoz való kötődését spektrofluorimetriás, ultraszűrés és kapilláris zónaelektroforézis technikákkal vizsgáltuk különös tekintettel a lehetséges kötőhelyek azonosítására. A szakirodalomban ismert volt korábban, hogy a KP1019 ehhez a fehérjéhez először másodlagos kémiai kölcsönhatások révén kötődik, majd átrendeződés révén koordinációs kötés alakul lassan [40]. A KP1339 és a KP1019 hidrolízisének [33]

visszaszorítása érdekében méréseinket leginkább 150 mM NaCl jelenlétében 25 °C-on, pH

= 7,40-en (foszfát pufferben) végeztük.

A komplexek közvetlen kölcsönhatását HSA-val spektrofluorimetria segítségével kezdtük el vizsgálni. Első lépésként a IIA aldoménben, azaz az I. kötőhelyen megvalósuló kölcsönhatást monitoroztuk a fehérje egyetlen Trp-jának (Trp214) emissziós tulajdonságán keresztül. Ennek az aminosavnak a szelektív gerjesztésekor (_EX = 295 nm) ha az I.

kötőhelyen kötődik egy vegyület, akkor ennek hatására megváltoznak a hidrofób-hidrofil viszonyok, ami hatással van a Trp emissziójának intenzitására. Ekkor a fehérje kezdeti emissziós intenzitása a vegyület hozzáadásával folyamatosan csökken (kioltás történik), és a csökkenés mértékéből a HSA-fémkomplex kölcsönhatásról nyerhetünk információt.

14. ábra (a) A HSA ‒ KP1339 rendszer fluoreszcencia emissziós spektrumai változó fehérje:komplex arányoknál mérve (fekete) és a HSA saját spektruma (piros). (b) A 334 nm-en mért relatív intenzitáscsökkenés (Int./Int.0 %) és a Stern-Volmer-féle egyenesillesztés a kapott pontokra (beszúrt ábra). {cHSA = 1 M; cKP1339 = 0-14,7 M; EX = 295 nm; 25 °C; pH = 7,40 (20 mM foszfát puffer, 150 mM NaCl)}

0

Eredmények és következtetések: Ruténium(III/II)komplexek vizsgálata

A HSA ‒ KP1339 rendszerben a Trp-kioltásos fluorimetriás mérések alapján a kémiai egyensúly gyorsan beáll, így 10-15 perc várakozási időt alkalmaztunk az emissziós spektrumok felvételekor. Ez a gyors, másodlagos kölcsönhatásokkal létrejövő kötődés farmakológiai szempontból előnyös, mert megnöveli a véráramban való tartózkodási időt, ami lassabb kiürülést eredményez. A mért intenzitásokat mindig korrigáltuk az oldatok jelentős abszorbanciája miatt (ld. belső filter hatás figyelembevétele 4.3.4. fejezet). A 14.a ábra a HSA ‒ KP1339 rendszer emissziós spektrumait mutatja különböző arányoknál rögzítve, és jól látható, hogy a HSA kezdeti emissziós intenzitása a hozzáadott komplex koncentrációjának növelésével folyamatosan csökken. A mért spektrumokból a PSEQUAD program [237] segítségével számítottunk kötési állandókat, de a Stern-Volmer-féle egyenesillesztést [242] is elvégeztük (14.b ábra). Ebben az esetben a kétféle módszerrel számolt állandó jó egyezést mutatott (1. táblázat). A KP1019 önmaga is emittál a vizsgált hullámhossz-tartományban, a fluoreszcens indazólium ellenionja miatt, így a Stern-Volmer módszerrel nem voltak kiértékelhetők a mért spektrumok. A PSEQUAD programmal [237]

viszont az egyensúlyi állandót meg tudtuk határozni (1. táblázat), mivel a program képes egyszerre több emittáló részecske kezelésére is.

1. táblázat A bisz-indazol-Ru(III)-komplexek különböző mérési technikák alapján számolt HSA kötési- és kiszorítási állandói. {25 °C, pH = 7,40 (20 mM foszfát puffer, 150 mM NaCl)}

KP1019 KP1339

Fluorimetria lgK’

Trp214 kioltás (PSEQUAD) (Stern-Volmer)

5,66(6)

‒

4,69(6) 4,66(6)

WF-kiszorítás 5,8(1) 5,7(1)

DG-kiszorítás 5,8(2) 5,3(1)

BR-kiszorítás 6,25(6) 6,01(2)

Ultraszűrés‒UV-látható sp.

lgK1’ 4,7(2) 5,0(1)

lgK2’ 4,6(2) 4,67(5)

Trynda-Lemiesz és munkatársai szintén tanulmányozták a KP1019 kölcsönhatását albuminnal ezzel a kioltásos módszerrel [248], azonban az általuk tapasztalt intenzitáscsökkenés inkább az alkalmazott nagy koncentrációk miatt fellépő belső filter hatásból eredhetett. A számolt látszólagos stabilitási állandók alapján a KP1339 komplex közel egy nagyságrenddel gyengébben kötődik az. I. kötőhelyhez, mint a KP1019. Ezt a különbséget nehéz megindokolni, hiszen a kötődő ágenseket hasonlónak gondoljuk, így a kölcsönhatást ultraszűrés‒UV-látható technikával vizsgáltuk tovább.

A HSA ‒ komplex rendszer ultraszűrés után kapott mintáinak LMM frakcióját UV-látható spektrofotometriásan vizsgáltuk és a megfelelő (külső) kalibrálást használva

dc_1661_19

Eredmények és következtetések: Ruténium(III/II)komplexek vizsgálata határoztuk meg a szabad fémkomplexek mennyiségét. A fehérjén kötött KP1339 komplex arányát mutatja a 15.a ábra az analitikai koncentrációk arányának függvényében.

Megállapítottuk, hogy a HSA két ekvivalens fémkomplex megkötésére volt képes mindkét fémkomplex esetében, és a meghatározott makroállandók (1. táblázat) az elleniontól függetlenül hasonló mértékű megkötődést mutattak. Ugyanakkor a szakirodalomban 1, 4 ill. 10 ekvivalens KP1019 komplex maximális megkötődését is leírták [36], ezekkel a mi adataink nem egyeznek. Azt azonban meg kell jegyezni, hogy a Ru(III)-komplexek egy része a fehérjék felületén gyengén kötődhet [249,250], viszont az ultraszűréssel ezek az adduktumok disszociálhatnak. Másrészt az ultraszűrés segítségével kapott állandók, melyek segítségével számolt koncentráció eloszlási görbéket mutat a 15.b ábra, csak a globális kötődési folyamatot írják le, de nem tükrözik az egyes kötőhelyekhez való affinitást.

15. ábra (a) A fehérjén kötött KP1339 egyensúlyi és a HSA analitikai koncentrációjának aránya az analitikai koncentrációk arányának függvényében, kísérleti pontok (két párhuzamos mérésből) és a lépcsőzetes stabilitási állandók alapján számolt görbe (szaggatott). (b) A számolt egyensúlyi koncentrációk az egyes részecskékre a HSA ‒ KP1339 rendszerben. {cHSA = 58 M; cKP1339 = 0‒

150 M; 25 °C; pH = 7,40 (20 mM foszfát puffer; 150 mM NaCl)}.

A IIA és IIIA aldoménekben megvalósuló kölcsönhatásokat háromféle marker segítségével monitoroztuk. A WF az I. kötőhely markere, a BR valószínűleg ezen kötőhely közelében, azt átfedve kötődik, míg a DG a II. kötőhelyen kötődik [243,244]. A 16.a ábra jól mutatja, hogy WF és DG vegyületeknek van, míg a BR-nak nincs mérhető saját emissziója, de emissziós intenzitásuk sokszorosára nő (ill. BR esetében megjelenik), amikor a fehérje megfelelő kötőzsebébe megkötődnek. A kötőhely kiszorításos méréseket megelőzően mindig meghatároztuk a mérési körülményeink között a kötőhely marker-HSA kölcsönhatást jellemző látszólagos stabilitási állandókat (lgK’= 5,6(1) (marker-HSA-WF);

0 1 2

0 1 2 3

[kötött KP1339] / cHSA

c_KP1339 / c_HSA a)

0 20 40 60

0 40 80 120

c_KP1339 / M

b)

[HSA(KP1339)]

[HSA(KP1339)₂] egyensúlyi koncentrációk/ M

dc_1661_19

Eredmények és következtetések: Ruténium(III/II)komplexek vizsgálata

5,2(1) (HSA-DG); 7,3(2) (HSA-BR)), melyek jó egyezést mutattak az irodalmi adatokkal [224,243,244,251,TP17]. Végeztünk méréseket más körülmények között is (pl. 37 °C;

HEPES puffer; pH = 8,5), de a kötési állandók csak kis mértékben változtak. A kiszorításos mérések során a HSA-t és a markert 1:1 arányban tartalmazó mintát titráltunk a fémkomplexszel, ami, ha kiszorítja a markert, akkor a mért intenzitás lecsökken, mivel a szabad marker kevésbé emittál, mint a HSA-hoz kötött. A szakirodalomban korábban is leírták már, hogy a KP1019 verseng az albumin kötőhelyeiért a WF-nal, de az adatok kvantitatív kiértékelése nem történt meg [248]. A kiszorítást kísérő intenzitáscsökkenést mutatja a 16.b ábra a HSA ‒ WF ‒ KP1339 rendszerben. A spektrumok felbontásával nyert kötési állandókat az 1. táblázatban mutatom be, melyek alapján megállapíthattuk, hogy mindkét vizsgált Ru(III)-komplex közepes erősséggel kötődik az I. és II. kötőhelyeken. A két komplex viselkedésében nincs lényegi eltérés, azaz az ellenionok különbözősége nem befolyásolja a HSA-hoz való kötődést. A Trp214 kioltásos méréseknél a KP1339 estében kapott kisebb állandó okaként azt valószínűsítettük a méréseink alapján, hogy kismértékű indazol ligandum disszociáció történik a komplexről (ez a KP1019 esetében visszaszorul az ellenion jelenléte miatt). A kis koncentrációban jelenlévő indazol saját emissziója megnöveli a mért intenzitást a vizsgált hullámhossz-tartományban, ami kisebb mértékű kioltást eredményez.

16. ábra (a) A kötőhely markerek és HSA komplexeik normált egyedi emissziós spektrumai, WF, HSA–WF (EX = 310 nm); DG, HSA–DG (EX = 335 nm) és HSA‒BR (EX = 487 nm), a [HSA‒

marker] spektrumokat a PSEQUAD programmal számítottuk. (b) HSA‒WF (1 M:1 M) rendszer KP1339 komplexszel (0-18 M) történő titrálásakor mért emissziós spektrumok. Beszúrt ábra: a mért (♦) és a számított (pontozott vonal) intenzitás változása 390 nm-en. {25 °C; pH = 7,40 (20 mM foszfát puffer, 150 mM NaCl)}

A spektrofluorimetriás mérések mellett a kötőhely markerekkel való kompetíciót a vízben jobban oldódó WF és DG esetében CZE és ultraszűrés‒UV-látható módszerekkel is vizsgáltuk. Ezen elválasztási módszereket alkalmazva a kis- és nagymolekulatömegű részecskék elválnak, ill. elválaszthatók egymástól. A markerek aktuális koncentrációját

0

Eredmények és következtetések: Ruténium(III/II)komplexek vizsgálata meg lehetett becsülni külső kalibrálás segítségével. Mindkét módszernél a kötőhely marker és a fémkomplex közötti versengés egyértelműen kimutatható volt, bár a számolt kötési állandók a CZE esetében valamivel kisebbek a spektroszkópiai módszer alapján várthoz képest, ami a kémiai egyensúly eltolódására utal.

A spektrofluorimetriás vizsgálatainkkal rámutattunk arra, hogy a két Ru(III)-komplex és a bilirubin között versengés tapasztalható az albuminhoz való kötődésben, melynek klinikai relevanciája van. A BR és a Ru(III)-komplexek versengését szemlélteti a 17. ábra, egy olyan hipotetikus rendszerben, ahol a HSA és a komplex ekvimoláris mennyiségben van jelen változó BR koncentráció mellett. A 11 M-os érték a BR normál koncentrációja a vérben, míg a 34 és 68 M már kóros állapotot (pl. májelégtelenség) jelez. A számításaink alapján az jósolható, hogy a BR koncentrációjának növekedésével a kiszorított Ru(III)-komplex mennyisége megnő, a két komplex viselkedése hasonló. Ha nő a szabad fémkomplex mennyisége, az fokozott mellékhatásokhoz vagy gyorsabb kiürüléshez vezethet [219,220]. Ezek az eredmények magyarázatul szolgálhatnak az emelkedett bilirubin szintű, azaz hiperbilirubinémiában szenvedő betegek KP1019 komplexszel történő kezelésekor tapasztalt rossz válaszreakciókra [250,253].

17. ábra Az I. (IIA aldomén) kötőhelyen a nem kötött („szabad”) KP1339 (kék) és KP1019 (piros)

%-os megoszlása egy hipotetikus HSA‒BR‒Ru(III)-komplex rendszerben, változó BR koncentrációk alkalmazásával. {cHSA = 630 M; cRu(III)-komplex = 630 M; fluorimetrás állandók (lgK’BR, lgK’BR-kiszorítás(KP1339/1019)) alapján számolva}.

0 4 8 12

11 34 68

HSA-hoz nem kötött Ru(III) %

c_BR/ M dc_1661_19

Eredmények és következtetések: Ruténium(III/II)komplexek vizsgálata

5.1.2. Ruténium(II)-nitrozil-indazol komplexek kölcsönhatása humán szérum