Az oxin és a szulfoxin galliumkomplexeinek oldategyensúlyi vizsgálata

A 8-hidroxi-kinolin (oxin, 8-HQ) komplexeinek vízoldhatósága közismerten rossz, de a ligandum pKa értékei meghatározhatók tisztán vizes oldatban UV-látható spektrofotometriás mérések mellett pH-potenciometriás titrálások segítségével is.

Ugyanakkor a Ga(III) komplexeinek sokkal rosszabb vízoldhatósága miatt a mérésekhez DMSO jelenléte is szükséges volt. Ennek megfelelően az oxin pKa-it 30% és 60% (m/m)-os DMSO/H2O oldószerelegyekben is meghatároztuk. Emellett az oxin jobb vízoldhatóságú analógjaként a szulfoxint (8-HQS, 21. ábra) is bevontuk a vizsgálatainkba összehasonlításként, ill. a háromféle oldószerben történtek mérések a maltollal is. A szulfoxin szulfonátcsoportja a vizsgált pH-tartományban mindvégig deprotonált formában van, és a negatív töltés révén így sokkal jobban oldódik vízben, mint az oxin. Az oxin,

Eredmények és következtetések: Galliumkomplexek vizsgálata szulfoxin ill. maltol különböző körülmények között meghatározott proton disszociációs állandóit az 5. és 6. táblázatok tartalmazzák. Az oxin és szulfoxin esetén kapott pK1 a kinolínium nitrogén (NH⁺) deprotonálódásához tartozik, míg a második lépcsőzetes deprotonálódási folyamat a fenolos hidroxilcsoporthoz köthető. A tiszta vizes közegben meghatározott egyensúlyi állandók jó egyezést mutatnak a szakirodalomban található, más körülmények között mért állandókkal [258-260]. Az oxin pK_a-i valamivel nagyobbak, mint a szulfoxiné a szulfonátcsoport elektronszívó tulajdonságának köszönhetően. Mind a két ligandumnál azt tapasztaltuk, hogy a tízszer hígabb (100 M) oldatban meghatározott pK1

kisebb, míg a pK2 nagyobb a töményebb (1 mM) oldatban kapotthoz képest (6. táblázat). A szakirodalom szerint ennek valószínű oka, hogy a HL részecske / (cisz/transz) formáinak aránya koncentrációfüggő [261], ami a pKa megváltozásához vezet.

Megfigyelhető, hogy a DMSO mennyiségének növelésével a pK1 értékek csökkennek, míg a pK₂ értékek növekednek.A relatív permittivitás (dielektromos állandó, r, a DMSO és a víz értékiből számolt érték) reciprokának függvényében ábrázolva a pKa értékeket lineáris összefüggést kapunk (37. ábra), ahol a pK1 értékekre illeszthető egyenes meredeksége negatív, míg a pK2 értékeknél pozitív. Ez jól magyarázható a Born-féle elektrosztatikus oldószer modellel [262]. Azaz a kationos savak (kinolínium-NH⁺) pKa-ja csökken, míg a semleges töltésű savak (fenolos-OH) pKa-ja növekszik a DMSO koncentrációját megnövelve, mert a DMSO a vízhez képest erősebben szolvatálja a semleges formákat.

37. ábra Korrelációs diagram a különböző DMSO koncentrációknál mért (a) pKa és (b) lg[GaLq] (q = 1,2, vagy 3) értékek és az oldószer(elegyek) számolt relatív permittivitásának reciproka (1 / r) között; L: maltol (×), oxin ( ,○) és szulfoxin ( ,∆). {I = 0,20 M (KCl) vízben (r = 78,3), I = 0,10 M (KCl) 30 (r = 76,7) és 60% (r = 72,4) (m/m) DMSO/H2O elegyben; 25,0 °C}

Fontos megjegyezni, hogy az oxin gyengén fluoreszkáló vegyület és a különböző pH-kon felvett emissziós spektrumok felbontásával a pK1 értéket meg lehetett határozni (6.

táblázat). A második lépcsőzetes deprotonálódási folyamat pH-tartományában csökkenni

5 15 25 35

0.0128 0.0131 0.0134 0.0137 lg[GaLq]

1/_r [GaL₃]

[GaL₂]

[GaL]

, , , ,

b)

2 4 6 8 10 12

0.0128 0.0131 0.0134 0.0137 pKa

1/_r

, , , ,

a) dc_1661_19

Eredmények és következtetések: Galliumkomplexek vizsgálata

kezdett a mért emissziós intenzitás, amit azonban az intenzitás növekedése követett, és az csak pH > ~11-n kezdett újra csökkenni. Ez az anomális viselkedés nem tette lehetővé a pK₂ számítását a fluorimetriás adatok alapján. A jelenség a szakirodalom szerint azzal magyarázható, hogy gerjesztett állapotban a semleges oxin molekula részben ikerionos (NH⁺ és O^–) formában van jelen, és inter/intramolekuláris H-hidak alakulhatnak ki, ami megakadályozza az alapállapotú molekula deprotonálódási állandójának fluorimetriás meghatározását [261,263]. tartalmazó ligandumokkal hasonló sémát követ, mint ahogyan az előző fejezetben bemutatott hidroxi-(tio)pironoknál láttuk; azaz mono-, bisz- és trisz-komplexek képződnek.

A komplexekre a különböző módszerekkel meghatározott stabilitási szorzatok a 6.

táblázatban találhatók meg. Az oxin esetében pH-potenciometriás méréseket nem lehet végezni tiszta vizes közegben, így 30 és 60% (m/m) DMSO/H2O oldószerelegyekben határoztuk meg az állandókat. Az oxin és szulfoxin mono-komplexeinek stabilitási szorzatát egyedi minták segítségével határoztuk meg UV-látható spektrofotometriásan, pH

dc_1661_19

Eredmények és következtetések: Galliumkomplexek vizsgálata

= 1-2 tartományban. A 37.b ábra trendje alapján jól látható, hogy a DMSO-tartalom (azaz az 1/r értékének) növelésével a stabilitási szorzatok is nőnek, de nemcsak az oxin, hanem szulfoxin és a maltol esetében is. Mivel a különböző közegekben meghatározott állandók lineáris összefüggést mutattak az oldószer(elegyek) relatív permittivitásának reciprokával mind a három ligandum esetében, az oxin Ga(III)-komplexeinek stabilitási állandóit tiszta vizes közegben a DMSO tartalmú mérések, valamint a szulfoxinra számolt adatokra illesztett egyenes meredeksége alapján extrapoláltuk. (6. táblázat). Ezek az extrapolált állandók jó egyezést mutattak az UV-látható spektrofotometriás titrálások segítségével nyert állandókkal.

38. ábra (a) A Ga(III) – oxin (1:3) rendszer 3D fluoreszcencia spektrumai pH = 7,40-en. (b) Fluoreszcencia mikroszkópos felvételek a KP46 komplex SW480 vastagbélráksejtekbe való bejutásáról 5 perces, ill. 3 órás inkubációt követően. (c) A Ga(III) – oxin (1:3) rendszer emissziós spektrumai különböző pH-kon mérve. (d) Az 530 nm-en mért emissziós intenzitások a pH függvényében 1:5 (◊); 1:3 ( ); 1:2 (∆) és 1:1 (○) fém-ligandum arányoknál és a ligandumra vonatkozóan (×). {cL = 50 M; EX = 367 nm; 25 °C; I = 0,20 M (KCl)}

A szakirodalomban ismert volt, hogy a Ga(III) trisz-oxináto komplexe erősen fluoreszcens [264]. Az oxin önmagában kevéssé emittál, de fluorogén tulajdonságának köszönhetően Ga(III)-ionhoz koordinálódva emissziós intenzitása közel a tízszeresére növekszik a [GaL3] komplexben. A spektrofluorimetria fémkomplexek stabilitási állandóinak meghatározásához való használata igen ritka a szakirodalomban [239], viszont

a)

0 200 400 600 800

450 500 550 600 650

Intenzitás / a.u.

_EM/ nm 3,05 5,43-6,02

6,44 9,39 9,84

0 200 400 600 800 1000

2 4 6 8 10

Intenzitás / a.u.

pH

c) d)

5 perc 20 m 3óra 20 m

b)

dc_1661_19

Eredmények és következtetések: Galliumkomplexek vizsgálata

rossz vízoldhatóságú fluoreszcens vegyületek esetében kifejezetten hasznos. A [trisz-oxináto-gallium(III)] komplex (8. ábra), azaz a KP46 3-dimenziós fluorimetriás spektruma a 38.a ábrán látható. Ezek alapján a komplex gerjesztési maximuma EX = 367 nm-nél van, az emissziós spektrumot pedig 450-650 nm tartományban érdemes mérni (példaként pH 2-11,5 tartományban 1:3 fémion-ligandum aránynál rögzített emissziós spektrumokat és a különböző fémion-ligandum arányok mellett mért intenzitásokat az emissziós maximumon az 38.c,d ábrákon mutatom). A mért spektrumok alapján számoltuk a bisz- és trisz-komplexek stabilitási szorzatait (6. táblázat), melyek igen hasonlónak adódtak a másik két módszerrel kapottakhoz, mutatva, hogy megfelelő fémion-ligandum rendszer esetén a fluorimetria is alkalmas módszer az oldatbeli stabilitás jellemzésére. A kapott adatok alapján mind a két 8-hidroxi-kinolin ligandum esetén a trisz-komplex az uralkodó részecske fiziológiás pH-n.

A KP46 intenzív fluoreszcens tulajdonságát (38.a) kihasználva javaslatunkra a Bécsi Egyetemen fluoreszcencia mikroszkópos technikával sikerült a komplex sejtekbe jutását is követni (38.b ábra). Az SW480 vastagbélrák sejteken végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a fémkomplex több órán keresztül stabilis maradt sejtes környezetben. Az is megfigyelhető volt, hogy a komplex percek alatt felhalmozódott a sejtekben, majd idővel a sejtmag körüli lemezes képletekben, feltehetően az endoplazmás retikulumban, ill. annak fehérje összetevőiben dúsult fel.

A két klinikai vizsgálatba került galliumkomplex oldatbeli stabilitásának összehasonlításához fiziológiás pH-n kiszámítottuk a fémion eloszlását a komplexek koncentrációjának függvényében (39. ábra). Az oxinnal képzett trisz-komplex stabilitási szorzata ~8 nagyságrenddel nagyobb, mint a maltol esetében. Ennek következtében igen híg, ugyanakkor fiziológiás szempontból releváns koncentrációtartományban az oxin komplex disszociációja jóval kisebb mértékű, mint a maltol komplexé. Az oldatban szabad maltol és [Ga(OH)4]^– jelenik meg. Az eredményeink alapján várható, hogy a két komplex vérszérumbeli eloszlása eltérő, hiszen a KP46 komplex nagy stabilitása révén kevésbé képes ligandumcsere folyamatokban részt venni, mint a trisz-maltoláto-komplex.

dc_1661_19

Eredmények és következtetések: Galliumkomplexek vizsgálata

39. ábra A Ga(III) maltollal (piros görbék) és oxinnal (lila görbék) képzett [GaL3] komplexeinek koncentráció eloszlási görbéi a komplex analitikai koncentrációjának függvényében pH = 7,4-n. A szaggatott vonalak az oxinkomplex vízoldhatatlan koncentrációtartományát jelölik. {I = 0,20 M (KCl); 25,0 °C}