EGFR inhibitorok kölcsönhatása humán szérum albuminnal

A növekedési faktorok és a receptor tirozin kinázok nemcsak a sejtek növekedését és differenciálódását szabályozzák, hanem a rosszindulatú daganatok kialakulásában is szerepet játszanak. Az EGFR gátlása ígéretes tumorterápiás célpont, amennyiben ezek a fehérjék túltermelődnek az adott ráktípusnál [282]. A gefitinib (62. ábra) volt az első EGFR inhibitor, melyet törzskönyveztek (2003-ban) [283], de azóta már számos ezen mechanizmus alapján működő új vegyület került klinikai használatba, pl. a harmadik

0 1 2 3

0 1 2 3 4 5 6 7 8

[kötött folát]/c(HSA)

c(folát)/c(HSA) -0.06

-0.04 -0.02 0.00 0.02 0.04

250 310 370 430

Abszorbancia

l/ nm ,

, , , , ,

a) b)

dc_1661_19

Eredmények és következtetések: Rákellenes nemfémes vegyületek kölcsönhatása albuminnal generációsnak számító osimertinib 2017-ben [284]. A farmakokinetikai vizsgálatok azt mutatták, hogy a gefitinib, az afatinib és az erlotinib (62. ábra) intenzíven kötődnek szérumfehérjékhez [285-287], de a HSA-hoz való kötődést jellemző egyensúlyi állandók meghatározására vonatkozó információ meglehetősen limitált és gyakran ellentmondó volt a szakirodalomban. Emiatt végeztük el ezen három gyógyszermolekula mellett az osimertinib és egy bizonyítottan EGFR-gátló hatású új fejlesztésű molekula (KP2187, 62.

ábra) albuminnal való kölcsönhatásának összehasonlító vizsgálatát.

13. táblázat A vizsgált EGFR inhibitorok spektrofotometriásan meghatározott proton disszociációs állandói (Ka), a különböző protonáltságú részecskék eloszlása és a vegyületek megoszlási hányadosa (D7,4) pH = 7,4-n. {I = 0,1 M (KCl); 25 C} HSA-val való kölcsönhatást jellemző látszólagos stabilitási állandók. {pH = 7,4 PBS puffer); 37 C}

gefitinib erlotinib afatinib KP2187 osimertinib

pKa1 5,27(2)

Protonáltsági állapot pH = 7,4-n (%)

H2L²⁺ - - - 1,5 - HSA és 10 M EGFR inhibitor koncentráció esetén.

A vegyületek pKa értékeit UV-látható spektrofotometriás titrálásokkal határoztuk meg, míg a KP2187 jobb vízoldhatósága (ld. lgD7,4 13. táblázatban) megengedte az állandók pH-potenciometriás, valamint fluoreszcens tulajdonsága a fluorimetriás titrálások segítségével történő meghatározását (13. táblázat). A KP2187 fluorofór csoportja kellően érzékenynek bizonyult a proton disszociációs folyamatokra: a deprotonálódással képződő formák fluoreszcenciája egyre inkább intenzívebbé vált (66. ábra). Az EGFR inhibitorok

dc_1661_19

Eredmények és következtetések: Rákellenes nemfémes vegyületek kölcsönhatása albuminnal első pKa-ja a kinazolin-gyűrűhöz rendelhető, az osimetrinib kivételével, ott a piridínium-nitrogénhez. A második pKa az alifás-nitrogénekhez tartozik: N(CH₃)₂H⁺ (afatinib, osimertinib), NH₃⁺ (KP2187) és N_morfolinH⁺ (gefitinib). A meghatározott pK_a-k alapján a vegyületek, az erlotinib kivételével, főképp az egyszeresen protonált HL⁺ formájukban vannak jelen fiziológiás pH-n, vizes oldatban.

A vegyületek fluoreszcens tulajdonságait különböző oldószerekben (hexán, benzol, n-oktanol, etanol, metanol, víz) és oldószerelegyekben is vizsgáltuk. Az afatinib és az osimertinib nem fluoreszcens egyik közegben sem, míg az erlotinib, a gefitinib és a KP2187 fluoreszcens sajátságai erős függést mutatnak az oldószer polaritásától és hidrogénkötés kialakítására való képességétől. Pl. a KP2187 semleges formájának emissziós intenzitása a vízben kicsi, míg alkoholokban H₂O << metanol < etanol << n-oktanol irányban jelentősen megnő, és hexánban gyakorlatilag nem fluoreszcens.

66. ábra (a) A KP2187 fluoreszcens spektrumai különböző pH-kon. (b) A vegyület koncentráció eloszlási görbéi és az emissziós intenzitás változása 477 nm-en a pH-függvényében. {cKP2187 = 10 M; lEX = 370 nm; I = 0,10 M KCl; 25 °C}

A HSA-val való kölcsönhatást elsősorban spektrofluorimetriás mérések segítségével jellemeztük; az ultraszűrést nem lehetett használni, mert a vízben legjobban oldódó KP2187 is jelentős mértékben a szűrőre tapadt (20-85%-ban, szűrőtípustól függően). A kölcsönhatás során nemcsak a fehérje, hanem a vegyületek saját emissziójának a megváltozásával is számolni kell. A HSA, a KP2187 és a HSA ‒ KP2187 rendszerre mért 3D fluoreszcencia spektrumok jól mutatják (67. ábra), hogy a kötődés során a HSA l_EM = 330 nm-nél lévő emissziós csúcsa kissé lecsökken, miközben a KP2187 saját intenzitása ~10-szeresére nő az adott körülmények között, másrészt lEX = 280 nm,lEM = 441 nm-nél megjelenik egy extra keresztcsúcs. Ez tipikus esete a fluoreszcens rezonancia energia transzfer (FRET) jelenségnek [242]. Hasonlóan az erlotinib és a gefitinib is a HSA jelenlétében sokkal erősebb fluoreszcenciát mutat.

0

Eredmények és következtetések: Rákellenes nemfémes vegyületek kölcsönhatása albuminnal

67. ábra A HSA (a), a KP2187 (b) és a HSA ‒ KP2187 (1:5) rendszer (c) 3D fluoreszcens spektrumai. A csúcsoknál a számok a csúcsok intenzitását jelölik az adott [lEX,lEM] értékeknél.

{cHSA = 1 M; cKP2187 = 5 M; pH = 7,4 PBS puffer; 37 °C}

A Trp214 kioltásos mérésekből mérsékelt kötődést lehetett megállapítani afatinib <

gefitinib ~ KP2187 < erlotinib sorrendben (lgK’ ~ 4), az osimertinib kivételével, ami majdnem egy nagyságrenddel erősebben kötődik az I. kötőhelyen, mint az afatinib (13.

táblázat). A WF kiszorításos mérések hasonló kötési állandókat eredményeztek, mint a közvetlen kioltásos mérések. Míg a II. kötőhely kötési markerének (DG) kiszorítása az afatinib, a gefitinib és az erlotinib esetében nem volt kimérhető effektussal járó folyamat.

A KP2187 esetében egyértelműen volt kompetíció, a jelentős spektrális átfedés miatt az adatok nem voltak alkalmasak kvantitatív kiértékelésre. A KP2187 esetében fluoreszcens élettartam-mérésekkel 370 nm-es gerjesztést használva kétféle átlagos élettartammal ( = 4,8(4) ns,  = 10,1(1) ns) jellemezhető HSA-KP2187 adduktumot lehetett leírni, ami szintén alátámasztja a kétféle kötőhelyen való megkötődést. A molekuláris dokkolásos számítások is a KP2187 I. és II. kötőhelyen történő megkötődését támasztották alá, de a vegyület semleges formájában, annak ellenére, hogy oldatban a HL⁺ forma az uralkodó. Az osimertinib pedig egyértelműen kötődik a II. kötőhelyen is a DG kiszorítás alapján.

A meghatározott kötési állandók alapján 10 M EGFR inhibitor és 630 M HSA koncentrációk mellett becslést végeztük a fehérjén kötött frakcióra (13. táblázat). A kötési állandók ugyan nem nagyok, de a fiziológiásan releváns körülmények között, azaz a HSA nagy feleslege mellett, a kötődés mértéke igen jelentős. 92% és 89%-os megkötődést számoltunk az erlotinib-re és a gefitinib-re, ami jó egyezésben van a 95% ill. 90%-os szérumfehérjékhez való kötődésre vonatkozó értékekkel, amiket a farmakokinetikai mérések alapján kaptak [285,286].

A vizsgált nemfémes vegyületek albuminnal való kölcsönhatásának tanulmányozása során nem csak arra mutattunk rá, hogy egy viszonylag gyengébb kötődésnek is szerepe van a szérumbeli eloszlásban, hanem a különböző kísérletes technikák alkalmazhatóságát és korlátait is össze tudtuk hasonlítani.

2214 [280,330]

110 [305,457]

87 [370,457]

2104 [280,330]

1060 [280,441]

972 [370,441]

1211 [310,441]

(a)a) (b)b) (c)c)

Intenzitás / a.u.

dc_1661_19

Összefoglalás

6. Összefoglalás

A terápiás és diagnosztikai felhasználású fémkomplexek gyakran jelentős változásokon mennek át az emberi szervezet víztereiben még a hatás helyszínéhez való megérkezésük előtt. Számos nemfémes rákellenes vegyület biológiai hatása ugyanakkor esszenciális fémionokkal való intra-, vagy extracelluláris komplexképződéssel kapcsolatos. Így a gyógyszerhatóanyagok racionális fejlesztési és optimalizálási folyamata során fontossá válik ezeknek a fémkomplexeknek az oldatbeli viselkedésének megismerése, azaz vizes oldatbeli stabilitásuk, aktuális megjelenési formájuk és redoxi tulajdonságaik feltárása.

Ezek a jellemzők a farmakokinetikai tulajdonságaikat is jelentősen befolyásolják, valamint a vérszérum transzportfehérjéivel (pl. albumin, transzferin) való kölcsönhatásuk erősségének, a képződő adduktumok összetételének és a kötés helyének leírása is fontos ebből a szempontból, mert a fehérjékhez való kötődés kihat a vegyület eloszlására és tartózkodási idejére a vérben. Dolgozatomban rákellenes hatású ruténium(III)-, gallium(III)komplexek, félszendvics fémorganikus ródium(III)(⁵-C5Me5)- és ruténium(II)(⁶-arén)-komplexek, tioszemikarbazonok fémkomplexeinek, valamint egyes nemfémes rákellenes vegyületek széles körű oldatkémiai vizsgálatával kapott eredményeinket mutattam be. Ezen eredmények alapján az alábbi legfontosabb következtetésekre jutottunk:

1. Klinikai vizsgálatokba került két bisz-indazol ruténium(III)komplex (KP1019, KP1339) és velük rokonszerkezetű ruténium(II)-nitrozil-indazol (ill. analóg ozmium(II)-) vegyületek humán szérum albuminnal való kölcsönhatását tártuk fel elsősorban közvetlen Trp214 kioltásos és kötőhely markerekkel való kompetíciós spektrofluorimetriás mérésekkel, kiegészítve azokat ultraszűrés és CZE módszerekkel.

1.1. Megállapítottuk, hogy a meglehetősen inertnek tekinthető KP1019 és KP1339