6. Következtetések, javaslatok
Az egyes környezeti tényezık (hımérséklet, tápközeg, kémhatás, UV sugárzás) M.
phaseolina in vitro micélium növekedésére és mikroszklerócium képzésére gyakorolt hatását vizsgáltuk, micélium kompatibilitásukat elemeztük. Az izolátumok genetikai diverzitását RAPD és PCR-RFLP alkalmazásával állapítottuk meg. Tenyészedényes vizsgálatban elemez-tük a M. phaseolina izolátumok patogenitását napraforgó és paprika növényen, továbbá három hazai izolátummal olyan növényfajok csírakori fogékonyságát, illetve ellenállóságát, amely növényeken a szakirodalom a kórokozó elıfordulásáról eddig még nem rendelkezett adatok-kal. Az eredmények megvitatását, valamint az azokból levont következtetéseket és javaslato-kat az alábbiakban részletezzük.
A hımérséklet hatását vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy a M. phaseolina hıtőrése széles in-tervallumban (10-40 °C) mozgott. A gomba növekedésének a meleg körülmények (25-35 °C hımérsékleti tartomány) kedveztek. Ez nem meglepı, hiszen ismert, hogy a gomba melegigé-nyes kórokozó, fıleg a trópusi, szubtrópusi területeken terjedt el. Azonban ha figyelembe vesszük, hogy Érsek 1979-ben megjelent publikációjában azt írta, hogy hazánkban a gomba 37-38 °C-on nem növekedett, akkor feltételezhetjük, hogy a kórokozó képes adaptálódni az elmúlt években kialakult felmelegedés során bekövetkezett magasabb évi középhımérséklet-hez, illetve a nyári idıszakban tapasztalt magasabb hımérséklethez. Tekintve, hogy a hazai éghajlatkutatók 2050-ig 0,5 °C-os évi középhımérséklet emelkedést és 10-15 %-os évi csapa-dékmennyiség csökkenést jeleztek, valószínősítjük, hogy hazánkban a további felmelegedés következményeként az ahhoz alkalmazkodni képes gomba populációk egyre nagyobb károsí-tásokat fognak okozni számos növényünk esetében.
Az egyes táptalajok hatását értékelve megállapítottuk, hogy legnagyobb mértékben KLA táptalajon növekedett a gomba, ezt követték a SGA, a MEA és a BDA-on kapott eredmények.
Így feltételezéseink szerint a gomba anyagcseréje során a dextrint hasznosítja legjobban, de kedvezı számára a glükóz és a maltóz is. A szacharóz tartalmú CDA táptalajon gyengébben, de jól növekedett. Eredményeink megegyeztek a Simay (1987), illetve Suriachandraselvan és Seetharaman (2003) munkájában közöltekkel, miszerint a gomba növekedése CDA táptalajon bizonyult a leglassúbbnak. Ezzel ellentétben eltértek Singh és Chohan (1982), illetve Singh és Kaiser (1994) eredményeitıl, akik a micéliumnövekedést és a mikroszkleróciumok
kialakulá-6. Következtetések, javaslatok
sát CDA-on való tenyésztés során találták a legintenzívebbnek. Munkánk során megállapítot-tuk, hogy bár a legkisebb mértékben, de képes növekedni és mikroszkleróciumokat képezni a gomba a tápanyaghiányos VA-on is, ahol legintenzívebbnek a Mp 39 növekedése bizonyult.
Ez arra enged következtetni, hogy a gomba képes nagyon szegény tápanyagellátottság mellett is az életben maradásra, a növekedésre, ezáltal biztosítva a fennmaradását és a tovább terjedé-sét. Mérési eredményeink alapján a M. phaseolina legkisebb mikroszklerócium átmérıje 39 µm, a legnagyobb 308 µm volt, míg a hat táptalaj átlageredményei 61,73-135,31 µm között alakultak. Fejlıdésükhöz a SGA táptalaj volt a legkedvezıbb, amely 135,31 µm átlag átmérı-ben mutatkozott meg. Ezen átmérıkbıl megállapítjuk, hogy a gombának Magyarországon Békési (1970) és Simay (1987) közlései után továbbra is a Haig szerinti C csoportba tartozó típusa van jelen.
A kémhatással – mint a M. phaseolinara ható környezeti tényezıvel – kapcsolatban egyetlen hazai publikációból tudtunk információhoz jutni, amely a gomba elsı hazai közlésében (Bé-kési 1970) szerepelt. Vizsgálataink szerint Bé(Bé-kési (1970) eredményeivel megegyezıen a gomba növekedésének pH optimuma 4,0-6,0 érték között volt. Ugyanakkor a gomba – ered-ményeink szerint – képes növekedni 7,0, 8,0 és 9,0 pH-jú BDA táptalajon is, ezért valószínő-sítjük, hogy az elmúlt évek hosszú sora alatt a kémhatás esetében is a gomba szélsıséges kö-rülményekhez való alkalmazkodása ment végbe. Így azt a következtetést vonhatjuk le, hogy napjainkban a talaj meszezése nem lehet a preventív védekezés eredményes módja, mint ahogy azt Békési (1970) a kórokozó elsı hazai közlésekor javasolta.
A micélium kompatibilitás vizsgálata során az összes lehetséges párosításból csupán 24 pá-rosítás esetén tapasztaltunk inkompatibilis kapcsolatot, az összes többi kapcsolat kompatibi-lisnek bizonyult. Ez azért jelentıs, mert a micélium kompatibilitás elıfeltétele annak, hogy két kompatibilis izolátum esetén az anasztomózisokon (hifahidakon) keresztül megtörténjen az örökítı anyag cseréje. Ez biztosít lehetıséget a genetikai rekombinációra (paraszexuális rekombináció), aminek a M. phaseolina esetében szerepe lehet a fajon belüli genetikai válto-zékonyság fenntartásában. Az pedig, hogy a hazai izolátumok kompatibilisek a szerb izolátummal, azt a feltételezést erısíti meg, miszerint a kórokozó országunkba – európai ter-jedése során észak felé nyomulása folyamán – Szerbia felıl került be. Ez azt bizonyíthatja, hogy az azonos, vagy nagyon hasonló genotípusú törzsek nagy távolságra is elterjedhetnek.
6. Következtetések, javaslatok
Hazánkban Nagy és Fischl (2002b) foglalkoztak az UV-C fény M. phaseolinara gyakorolt hatásával. Vizsgálataik során megfigyelték, hogy az 1,62 J/cm2 dózisú UV-C sugárzás a micé-lium növekedését 48 órára gátolta és további 48 órára fenntartható volt a gátlás 0,81 J/cm2 dózissal. Ezzel szemben mi azt tapasztaltuk, hogy az 1,62 J/cm2 dózisú UV-C sugárzás a mi-célium növekedését „csak” jelentıs mértékben csökkentette, de nem gátolta, azonban a Mp 1, a Mp 10, a Mp 19, a Mp 22 és a Mp 24 izolátumok mikroszklerócium képzését 48 órára gátol-ta. Az UV sugárzás növekedést gátló hatása valószínőleg onnan eredeztethetı, hogy a gomba hifa csúcsi sejtje nem rendelkezik kettıs sejtfallal, míg a hifa többi részén a külsı sejtfal réteg képes megvédeni a hifát az UV sugárzástól. Nagy és Fischl (2002b) eredményei szerint az UV sugárzás befolyásolta a M. phaseolina mikroszkleróciumainak számát, átmérıjüket, azok mé-ret szerinti eloszlását, továbbá azok átmérıje kisebb volt, mint a kontrollé. Ezen paraméterek mérése nem képezte vizsgálatunk tárgyát, azt azonban megfigyeltük, hogy a kezelt tenyésze-tekben kevesebb számú mikroszklerócium képzıdött. A gomba reprodukciójában – a hımér-sékleten, a páratartalmon, a kémhatáson és a tápközegen kívül – az UV sugárzás intenzitása is fontos faktor lehet. Amennyiben az ózonpajzs elvékonyodása következményeként a közeli UV sugárzás intenzitása növekedni fog, úgy elképzelhetı, hogy a talajon (pl. növényi marad-ványokon) maradt gomba az UV sugárzás hatására kevesebb mikroszkleróciumot képez. To-vábbi vizsgálatok tárgyát képezhetné az UV fénnyel megvilágított tenyészetek molekuláris genetikai analizálása is a célból, hogy megtudjuk, molekuláris szinten milyen változások kö-vetkeztek be a gomba DNS-ében.
A fenotípusos változások a genotípusban bekövetkezett változások következményei, ezért klasszikus mikológiai vizsgálataink után molekuláris genetikai elemzéseket végeztünk. Ma-gyarországon ez idáig nem foglalkozott egy tanulmány sem a M. phaseolina mtDNS analízi-sével. Csak külföldi szakirodalmakban találtunk a gomba genetikai variabilitásával kapcsola-tos RAPD és RFLP módszerekkel végzett molekuláris genetikai eredményeket. A PCR-RFLP során a rDNS ITS régióját felszaporítottuk, majd a Taq I restrikciós endonukleázzal való emésztés után monomorf mintázatot kaptunk, ahogy korábban Chase és mtsai. (1994), Su és mtsai. (2001), illetve Purkayastha és mtsai. (2006). Viszont Chase és mtsai. (1994) eredményeivel ellentétben a BstU I enzimmel kapott gélképen a mi izolátumaink között poli-morfizmust figyeltünk meg . A BstU I, a Hae III, a Hinf I, az Mbo I, az Msp I és az Rsa I en-zimekkel végzett PCR-RFLP során polimorf restrikciós mintázatot kaptunk. Ezzel szemben Almeida és mtsai. (2003) monomorf mintázatról adtak közlést a Hae III. és a Mbo I endonukleázokkal végzett kísérleteik értékelésekor. Továbbá Su és mtsai. (2001) sem tudtak
6. Következtetések, javaslatok
polimorfizmust kimutatni azon vizsgálataikban, ahol Hae III., Mbo I, Msp I és Rsa I endonukleázokat használtak. Jól használható az ITS-RFLP a polimorfizmus kimutatására, ha feltételezhetı az izolátumok közötti nagy genetikai távolság, amelyre utalhatnak például az elızetes mikológiai vizsgálatok vagy a nagy geográfiai távolság. A klasszikus mikológiai vizsgálatokat figyelembe véve az izolátumok összehasonlítása során fenotípusosan a Mp 34, a Mp 38 és a Mp 45 egymáshoz nagyon hasonlóak, a többi izolátumtól viszont eltérı eredményt mutattak, amit a RAPD és a PCR-RFLP módszerek segítségével genotípusosan is igazoltunk.
A többi izolátum között is találtunk kisebb különbségeket a RAPD analízis során, ezek azon-ban nem voltak egységesek. Javasoljuk, hogy képezze további vizsgálatok tárgyát a rDNS ITS régiójának szekvencia analízise, amellyel a nukleotidok (adenin, guanin, citozin, timin) sor-rendjét meghatározva további részletes és pontos információhoz lehet jutni az izolátumok közötti genetikai diverzitással kapcsolatban.
A M. phaseolina folyamatosan bıvülı gazdanövényköre, illetve a gyomnövények egyre na-gyobb térhódítása arra ösztönzött bennünket, hogy inokulációs kísérletben magyarországi izolátumokkal olyan növényfajok csírakori fogékonyságát, illetve ellenállóságát vizsgáljuk, amelyek a gomba gazdájaként eddigi szakirodalmi adatok alapján nem ismeretesek. Eredmé-nyeink szerint a 39 vizsgált növényfajból öt (Amaranthus caudatus, Apera spica-venti, Lepidium sativum, Spergula arvensis, Trifolium hybridum) kifejezetten fogékony a kórokozó iránt, 13 közepesen fogékony, 19 kevésbé fogékony és csupán kettı (Phytolacca americana, Aegilops cylindrica) ellenálló a kórokozóval szemben. Jelezzük, hogy amennyiben a termé-szetben kapcsolatba kerül a gomba ezen növényfajokkal, úgy feltehetıen nagy mértékben fog károsítani, hiszen azokat már csíranövény korban képes elpusztítani. Szerintünk a M.
phaseolinara fogékony növények kelése természetes fertızıdés következtében hiányos lesz, csökken a csírázási százalékuk, a csíranövények életképessége és azok növekedése, s mind-ezek miatt kevesebb lesz a növények termése. További vizsgálatok szükségesek ahhoz, hogy megtudjuk, a gomba természetes fertızése esetén milyen mértékő károsító hatással bír a vizs-gálatunkban részt vevı növényekre. Véleményünk szerint még több növényfaj fogékonyságát szükséges vizsgálni, hogy adatokat kapjunk a kórokozó új, a gomba iránt fogékonyságot mu-tató további potenciális gazdanövényekrıl. Érdemes figyelembe venni, hogy a fogékony nö-vények elısegíthetik a gomba életben maradását és primer fertızési forrásként szolgálhatnak.
Többen vizsgálták a gomba károsító hatását rövidebb-hosszabb ideig tartó vizsgálatok so-rán. Az általunk alkalmazott módszer a korlátozott kutatási feltételek miatt nem túl hosszú
6. Következtetések, javaslatok
idıtartamú, azonban úgy gondoljuk nem is túl rövid, hiszen az általunk alkalmazottaknál rö-videbb idı alatt végzett módszerekkel is találkoztunk a szakirodalomban (Thirumalachar és mtsai. 1977, Manici és mtsai. 1995, Grezes-Besset és mtsai. 1996). Eltérı eredményekrıl ol-vastunk a szakirodalomban a gomba patogenitását illetıen, ezért két növényfajon vizsgáltuk izolátumaink patogenitását. Thirumalachar és mtsai. (1977), illetve Manici és mtsai. (1995) munkájuk során azt tapasztalták, hogy az izolátumok patogenitása növényfajonként eltért, míg Monga és mtsai. (2004) illetve Reyes-Franco és mtsai. (2006) nem értettek ezzel egyet. Vizs-gálataink alapján elmondhatjuk, hogy a kórokozó általában a napraforgót nagyobb mértékben károsította, mint a paprikát. Statisztikai eredményeink alapján megállapítottuk, hogy nincs összefüggés a gomba napraforgón és paprikán eredményezett patogenitásában, a kelési, a szár- és a gyökéreredményeket alapul véve. Kísérletünk során minden izolátum patogénnek bizonyult, bár a növények kelési, szárhossz, szártömeg, gyökérhossz és gyökértömeg eredmé-nyeit alapul véve eltérı mértékben. A Mp 7 és a Mp 33 csak napraforgón, a Mp 18 csak pap-rikán bizonyult patogénnek. Nagy különbségeket tapasztaltunk az izolátumok patogenitásában a nem patogéntıl a rendkívül patogén kategóriáig. Ahogy korábban Meyer és mtsai. (1973) 10-65 %-os szója kelést, Suriachandraselvan és Seetharaman (2000) 38,3-88,3 %-os naprafor-gó kelést, illetve Purkayastha és mtsai. (2004) 21-67 %-os csomósbab kelést tapasztaltak, úgy vizsgálatainkban is széles intervallumban mozgott a M. phaseolina izolátumok patogenitása.
A kontroll százalékában kifejezve az inokulált napraforgó kelése 3,54 és 100,00 % között, illetve az inokulált paprika kelése 41,37 és 100,00 % között mozgott. Izolátumonként külön-bözı mértékben ugyan, de elmondható, hogy a gomba csökkentette az inokulált napraforgó és paprika szárának és gyökerének a hosszát, tömegüket viszont nem minden esetben.
A gazdanövénykör vizsgálatánál és a patogenitás értékelésénél sem tapasztaltunk olyan gom-ba okozta tüneteket, amelyekrıl korábbi szakirodalmak beszámoltak (gyökérnyaki lézió, szárnekrózis, barna vagy feketés léziók szikleveleken és/vagy a száron). Feltételezzük, hogy vizsgálataink alatt a gombának nem volt elég ideje ahhoz, hogy ilyen tüneteket produkáljon a növényeken.
Meg kell még említeni, hogy a tenyészedény behatárolta mind a kezelt, mind a kontroll növé-nyek gyökérnövekedését. Szerencsés lenne ezen vizsgálatok elvégzése más körülménövé-nyek kö-zött, például szabadföldön is, ahol a növények gyökerei szabadon nıhetnek. Valószínősítjük, hogy a kontroll növények hosszabb gyökereket is fejlesztettek volna, amire a tenyészedény alján lévı lyukakon megjelent gyökerekbıl következtettünk. Ezt a kezelteknél nem tapasztal-tuk.
6. Következtetések, javaslatok
A patogenitás vizsgálat végén – ahogy korábban például Meyer és mtsai. (1973), Pratt és mtsai. (1998) vagy Rajeev és Mukhopadhyay (2002) – mi is vissza tudtuk izolálni a kóroko-zót minden kezelt növényszárból. Így fertızıdötteknek tekintettük az összes inokulált nö-vényt, még ha nem is járt ez a fertızıdés csíranövény pusztulással, „csak” rövidebb vagy könnyebb szárral, illetve gyökérrel.
Az általunk javasolt további vizsgálatok szükségesek a M. phaseolina fiziológiájának rész-letesebb megismeréséhez, amit az a tény indokol, hogy a gomba a hazánkban nem ritka aszá-lyos idıjárás esetén a termésveszteséget tovább fokozhatja.
7. Összefoglalás
7. Összefoglalás
Munkánk során részletesen foglalkoztunk a M. phaseolina gomba növekedését és károsítá-sát befolyásoló tényezık vizsgálatával.
Laboratóriumi vizsgálatainkat a hımérséklet, a kémhatás és különbözı táptalajok a gomba növekedésére és mikroszkleróciumainak képzésére gyakorolt hatásával kezdtük. Megállapí-tottuk, hogy mindegyik általunk vizsgált hımérsékleten, pH-n és táptalajon képes növekedni a M. phaseolina. A gomba növekedéséhez a 25-35 °C, a 4-6 pH és a kukorica-liszt agar táptalaj bizonyult optimálisnak. Szélsıséges körülmények között is, azaz 10 °C és 40 °C-on, 2,0 és 9,0 pH-n, továbbá a tápanyagszegény vizes agar táptalajon is növekedett a gomba.
Az izolátumok tenyészeteinek makromorfológiáját vizsgálva az egyes táptalajokon külön-bözı mértékő légmicéliumképzést, illetve eltérı zónázottságú mikroszkleróciumtelepeket figyeltünk meg. A gomba vizes agaron általában csak néhány mikroszkleróciumot képzett elszórtan a Petri-csészében. Egyetlen izolátum esetében (Mp 38) pepton tartalmú táptalajon (SGA) a gomba, illetve annak anyagcsereterméke a táptalajt halvány pirosra színezte el. A mikroszkleróciumok morfológiai vizsgálatakor azok átmérıjében állapítottunk meg nagyobb eltéréseket. Eredményeink alapján a mikroszkleróciumok átmérıje 39-308 µm között alakult.
Eredményeink szerint a kórokozó mikroszkleróciumainak növekedéséhez a Sabouraud-glükóz agar táptalaj kedvezett a leginkább, ami 135,31 µm átlag átmérıben mutatkozott meg.
A mikroszkleróciumok alakja többségében gömb volt, míg az Mp 34 izolátumnál tojásdad alakot is találtunk. Laboratóriumi vizsgálatainkat folytatva a micélium kompatibilitás értéke-lése során megállapítottuk, hogy izolátumaink többnyire kompatibilisek egymással. Az izolátumok összes lehetséges párosításából csupán 24 párosítás esetén figyeltünk meg inkom-patibilis kapcsolatot. A legtöbb esetben a Mp 34 mutatott inkompatibilitást más izolátumokkal.
A M. phaseolina különbözı dózisú UV-C sugárzással történı megvilágítása során azt ta-pasztaltuk, hogy az a gomba növekedésének sebességét jelentısen csökkentette, továbbá befo-lyásolta a mikroszkleróciumok számát, illetve a tenyészetben való eloszlásukat. Az 1,62 J/cm2 dózisú UV-C sugárzás a gomba növekedését és a mikroszkleróciumok képzıdését átlagosan a negyedére csökkentette, továbbá a Mp 1, a Mp 10, a Mp 19, a Mp 22 és a Mp 24 izolátumok mikroszklerócium képzését 48 órára gátolta. Összefüggés-vizsgálatokkal statisztikailag is
7. Összefoglalás
igazoltuk, hogy a besugárzás dózisának csökkenésével emelkedett a gomba növekedésének mértéke. A klasszikus mikológiai vizsgálatok során a Mp 34, a Mp 38 és a Mp 45 izolátum tért el nagy mértékben a többi izolátumtól.
A molekuláris genetikai vizsgálatok során a RAPD vizsgálat eredményezte dendrogram se-gítségével meghatároztuk, hogy a vizsgált izolátumok többsége 0,2 genetikai távolságon belül volt. A Mp 34, a Mp 38 és a Mp 45 izolátum a többi izolátumtól a legnagyobb genetikai tá-volságra (0,75) voltak. Az izolátumok geográfiai távolsága és a genetikai távolságuk közti összefüggés szignifikáns volt, azonban gyenge (r=0,402). Az izolátumok gazdanövények sze-rint nem csoportosultak genotípusosan, továbbá a genetikai és a micélium kompatibilitás vizsgálatok eredményei között sem tapasztaltunk összefüggést. A klasszikus mikológiai vizs-gálatokat figyelembe véve az izolátumok összehasonlítása során az Mp 34, az Mp 38 és az Mp 45 egymáshoz nagyon hasonlóak, a többi izolátumtól viszont eltérı eredményt mutattak, amit a RAPD során kapott egyforma genetikai távolság is igazolt. A többi izolátum között is találtunk kisebb különbségeket, amelyek azonban nem voltak egységesek.
A PCR-RFLP során nyolc restrikciós enzimmel emésztettük az ITS5 és az LR5 primerekkel felszaporított ∼ 1550 bp mérető fragmentumot. Az EcoR I és a Taq I enzimekkel monomorf, a BstU I, a Hae III, a Hinf I, az Mbo I, az Msp I és az Rsa I enzimekkel polimorf restrikciós mintázatokat kaptunk. A Mp 34, Mp 38 és Mp 45 hat enzimmel (BstU I, Hae III, Hinf I, Mbo I, Msp I, Rsa I) történı emésztés során elkülönült a többi izolátumtól. A Hae III és az Msp I enzimekkel ezen 3 izolátum mindegyike különbözı restrikciós mintázatot adott, míg a vizsgá-latban használt másik 4 enzimmel a spanyol Mp 45 izolátum tért csak el a két magyar (Mp 34, Mp 38) izolátumtól. Megállapítottuk, hogy a Mp 34, Mp 38 és Mp 45 izolátumok nemcsak fenotípusosan, hanem genetikailag is nagy variabilitást mutattak.
Tenyészedényes vizsgálataink egyik részében 39 olyan növényfaj csírakori fogékonyságát, illetve ellenállóságát vizsgáltuk 3 magyarországi M. phaseolina izolátum (Mp22, Mp23, Mp33) felhasználásával, amelyeken a gomba patogenitásáról a szakirodalomban eddig még nem volt adat. Számos növényfaj fertızhetıségét kimutattuk a gomba hazai izolátumaival.
Eredményeink szerint 39 vizsgált növényfajból 5 növényfajról (Amaranthus caudatus, Apera spica-venti, Lepidium sativum, Spergula arvensis, Trifolium hybridum) bizonyítottuk a kór-okozó iránti kifejezett fogékonyságot, 13 közepesen fogékony, 19 kevésbé fogékony volt és 2 (Phytolacca americana, Aegilops cylindrica) ellenállt a kórokozóval szemben.
7. Összefoglalás
Tenyészedényes vizsgálataink másik részében vizsgálni kívántuk a M. phaseolina patogenitását, napraforgó és paprika növekedésére gyakorolt hatását. Statisztikai analízis alap-ján megállapítottuk, hogy nincs összefüggés a kórokozó napraforgón és paprikán eredménye-zett patogenitásában, a kelési, a szár- és a gyökéreredményeket alapul véve. Az izolátumok patogenitása tág határok között mozgott, amelyet a kelési eredmények alapján öt csoportba soroltunk. A gomba többnyire nagyobb mértékben károsította a napraforgót, mint a paprikát.
Napraforgón a Mp 35, paprikán a Mp 38 károsított a legnagyobb mértékben. A fertızött nö-vényekbıl minden esetben sikerrel izoláltuk vissza a kórokozót.