A GgtA-t kódoló gén azonosítása, a ∆ ggtA törzs és tulajdonságai

Az A. nidulans genomja két γGT domainnel rendelkező gént is tartalmaz: Az AN10444 gén egy “Pezizomycotina-only” klád (GGT1 szubklád) csoportba sorolható fehérjét kódol, míg az AN5658 gén feltételezett terméke a Pezizomycotina-Saccharomycotina (GGT3) klád tagja (Bello és Epstein 2013). Mindkét gén indukálódott szénéhezés hatására (5.

melléklet). Az AN10444 (ggtA) deléciója teljes egészében megszüntette a sejtek és a fermentlé γGT aktivitását, míg az AN5458 gén deléciója érdemben nem befolyásolta azt (12.

táblázat). Mindezek alapján az AN1444 gén volt a felelős a (szénéhező) tenyészetekben megfigyelt γGT aktivitásokért. Ez azonban nem zárja ki annak a lehetőségét, hogy az AN5458 gén is egy γGT-t kódol, csak aktivitása az általunk használt módszerrel (Spitzmüller és 12. táblázat Deléciós és komplementált A. nidulans törzsek specifikus γGT aktivitásai

A glükóz szénforráson felnövesztett kései exponenciális fázisú (18 h) micéliumot egyedüli szénforrásként 5 g/l kazein peptont tartalmazó tápközegbe mostuk át. Az extracelluláris γGT aktivitások méréséhez a mintákat a 100 h tenyészetekből vettük. Az intracelluláris γGT aktivitásokat a 18 h, illetve a 48 h tenyészetekből határoztuk meg. A táblázat 4 független mérés átlagait és szórásait tartalmazza. A 18 h (átmosás előtti) tenyészetekből extracelluláris γGT aktivitást nem tudtunk kimutatni.

Meglepő módon a ggtA deléciója nem befolyásolta a szénstressznek kitett tenyészetek GSH anyagcseréjét (25. ábra), azaz a GgtA enzim nem szükséges a sejtek szénstressz alatt bekövetkező GSH tartalmának csökkenéséhez. Bár sokáig a γGT-t tartották a legfontosabb GSH lebontó enzimnek (Pócsi és munkatársai 2004), az újabb vizsgálatok alapján a citoszolikus GSH lebontásában sok faj esetében más enzimek működnek közre.

25. ábra A ggtA gén deléciójának hatása az A. nidulans tenyészetek GSH tartalmának csökkenésére A glükóz szénforráson felnövesztett kései exponenciális fázisú micélium (tNJ190-1 ∆ggtA törzs – fekete szimbólumok; tNJ36 kontroll törzs – fehér szimbólumok) szénforrás mentes tápközegbe (A), illetve 20 g/l laktózt tartalmazó tápközegbe (B) lett átmosva („●” és „○” szimbólumok). A táplevesek egy része 5 g/l kazein peptonnal lett kiegészítve („■” és „□” szimbólumok). Az ábrákon 4 független mérés átlagai és szórásai szerepelnek. A sejtek GSSG tartalma 0,3-0,5 nmol/mg DCM között volt minden mintavételi pont esetében. Extracelluláris GSH és GSSG jelenlétét nem sikerült detektálnunk.

A kontroll és a ∆ggtA törzs között nem volt szignifikáns (Student-féle t-teszt, p < 0,05) különbség. A tNJ190-2, tNJ190-3, tNJ151-1 és tNJ151-2 törzsek viselkedése hasonló volt a tNJ190-1 és a tNJ36 törzsek viselkedéséhez.

Emlős sejtekben a ChaC γ-glutamil ciklotranszferáz vesz részt az intracelluláris GSH lebontásában, míg a citoplazma membránhoz kötött γGT az extracelluláris GSH lebontásáért felelős (Kumar és munkatársai 2012). Növényekben (Arabidopsis thaliana) szintén egy γ -glutamil ciklotranszferáz bontja le a citoszolikus GSH-t; a sejtfal γGT-ai az extracelluláris GSSG hidrolízisét végzik (Ohkama-Ohtsu és munkatársai 2008). A S. cerevisiae esetében a γGT a vakuoláris GSH lebontását biztosítja, míg a citoszolikus GSH a DUG (Deficient in Utilization of Glutathione) útvonalon keresztül bomlik le. A DUG útvonal három génből áll: a dug2 és a dug3 egy glutamin amidotranszferáz alegységeit kódolja, míg a dug1 egy Cys-Gly dipeptidáz génje (Kumar és munkatársai 2003, Ganguli és munkatársai 2006, Kaur és munkatársai 2012). A DUG útvonal a Candida albicans GSH anyagcseréjében is fontos (Desai és munkatársai 2011) és a dug gének ortológjai elterjedtek a gombák körében és megtalálhatóak az A. nidulans genomjában is. Elképzelhető, hogy ezen útvonal felelős a szénstressznek kitett A. nidulans tenyészetekben tapasztalt GSH koncentráció csökkenésért.

Ezt a lehetőséget támasztja alá az a megfigyelés is, miszerint szénéhezés hatására a dugA (AN1092; dug1 ortológ) és a dugC (AN3459; dug3 ortológ) gének indukálódtak (Spitzmüller és munkatársai 2015b).

Több megfigyelés is arra utal, hogy a γGT fiziológiai funkciója kapcsolatba hozható az extracelluláris fehérjék lebontásával és az extracelluláris proteinázok képződésével:

1) A GgtA szénstressz alatt termelődött (22. ábra), azaz olyan körülmények között, amikor az alternatív energiaforrások (pl. extracelluláris fehérjék) hasznosítása kritikus a gomba számára.

2) Képződését kazein peptonnal indukálni lehetett (22. ábra), de indukáló hatásúnak bizonyult a marha szérumalbumin (BSA), az élesztőkivonat, a Glu és a Gln is (Spitzmüller és munkatársai 2015a).

3) Az extracelluláris proteináz termelés szintén indukálódott szénstressz hatására (Szilágyi és munkatársai 2010b) és a peptidek jelenléte növelte a szekretált proteinázok mennyiségét is (Szilágyi és munkatársai 2010b, 2011, Spitzmüller és munkatársai 2015a), ugyanakkor a proteináz termelést befolyásoló számos mutáció (pl. a FadA és GanB jelátviteli útvonalak mutációi) a γGT aktivitásokat is megváltoztatta (Molnár és munkatársai 2004, 2006).

4) A kleisztotéciumok képződését a ggtA géndeléció, valamint az extracelluláris proteinázokat kódoló prtA és pepJ gének deléciója egyaránt kedvezőtlenül befolyásolta (Spitzmüller és munkatársai 2015a, Emri és munkatársai 2018a).

Szénéhező körülmények között az A. nidulans tenyészetek redox egyensúlya felborul (Emri és munkatársai 2004a, 2004b). Vizsgálataink alapján kazein pepton adagolásával a redox egyensúlyvesztés mérsékelhető volt (26. ábra).

26. ábra A kazein pepton hatása a szénéhező A. nidulans tenyészetek redox homeosztázisára

A glükóz szénforráson felnövesztett kései exponenciális fázisú (20 h) micéliumot (1, tNJ190-2, tNJ190-3 ∆ggtA törzsek – szürke oszlopok; tNJ36 kontroll törzs – fehér oszlopok) szénforrás mentes tápközegbe (GD; „glucose depleted”), illetve egyedüli szénforrásként kazein peptont tartalmazó tápközegbe (pepton) mostuk át. A mintákat az átmosást követő 25 h és 50 h időpontokban vettük. Az ábra 4 független mérés átlagait és szórásait tartalmazza. A redox egyensúly felborulását a DCF képződésével jellemeztük. A képződött DCF mennyisége az 50 h tenyészetekben szignifikánsan (Student-féle t-teszt, p < 0,05) nagyobb volt, mint a 25 h tenyészetek esetén. A „*” szimbólumok a kontroll törzstől való szignifikáns (Student-féle t-teszt, p < 0,05) eltérést jelölik egy adott mintavételi időpontban.

A kazein pepton ezen jótékony hatása a ∆ggtA törzsekben azonban szignifikánsan kisebb mértékben érvényesült, noha a ggtA gén deléciója önmagában nem befolyásolta a szénéhező tenyészetek redox homeosztázisát (26. ábra). E vizsgálatok szintén arra utalnak, hogy az extracelluláris γGT és az extracelluláris proteinázok nemcsak képződésük szabályozását, de funkciójukat tekintve is összefügghetnek egymással. A GgtA lúgos pH optimuma (23. ábra), nagy transzpeptidáz, de kis hidroláz aktivitása (11. táblázat), valamint a Gln γ-glutamil donorként történő felhasználása (24. ábra) alapján elképzelhető, hogy ez az enzim nem γ -glutamil vegyületek bontásával, hanem γ-glutamil vegyületek szintézisével járul hozzá az extracelluláris fehérjék/peptidek hasznosításához. Irodalmi adatok alapján a γ-glutamil vegyületek fontos szabályozó feladatokat láthatnak el (Viña és munkatársai 1985), illetve az eredeti peptideknél, aminosavaknál kedvezőbb tulajdonságokkal (pl. nagyobb oldékonyság, illetve stabilitás) rendelkezhetnek (Hara és munkatársai 1992, Suzuki és munkatársai 2007);

mindkettő érdemben befolyásolhatja a peptidek/fehérjék extracelluláris hasznosítását.