3.1 Az Aspergillus nidulans oxidatív stresszválasza
A gombák stresszválaszaival kapcsolatos vizsgálataink kezdetén (a 90-es évek közepén) a fonalas gombák (oxidatív) stresszválaszainak vizsgálata messze elmaradt az élesztőkéhez képest. Ahhoz, hogy a fonalas gombákat felhasználhassuk kutatásainkhoz mindenekelőtt demonstrálnunk kellett, hogy e fajokban is kiváltható az oxidatív stressz reprodukálható és stresszor specifikus módon. E vizsgálatokhoz egy ipari jelentőségű (penicillintermelő) Penicillium chrysogenum törzset használtunk (Emri és munkatársai 1997a, 1999), majd az itt gyűjtött tapasztalatokat adaptáltuk az A. nidulansra, hogy lehetőségünk legyen DNS chip vizsgálatok kivitelezésére is (Pócsi és munkatársai 2005). Kimutattuk, hogy az oxidatív stresszválasz nem egységes, hanem nagymértékben függ az oxidatív stresszt előidéző stresszor típusától (Pócsi és munkatársai 2005). Annak érdekében, hogy képet kapjunk az oxidatív stresszválasz szabályozásáról is, egy, a szabályozásban potenciálisan résztvevő transzkripciós faktorral kezdtünk el foglalkozni. Választásunk a gombák stresszválaszait, szekunder anyagcseréjét, differenciációját és virulenciáját egyaránt befolyásoló AtfA transzkripciós faktorra esett (Balázs és munkatársai 2010). Az irodalmi adatokkal összhangban (Hagiwara és munkatársai 2008, Lara-Rojas és munkatársai 2011) igazoltuk, hogy az AtfA valóban részt vesz az A. nidulans oxidatív stresszválaszának szabályozásában, de nem befolyásolja érdemben a gomba ozmotikus stressz érzékenységét (Balázs és munkatársai 2010). E munka folytatásaként az alábbi kérdések megválaszolását terveztük:
– Azonosíthatóak-e az oxidatív stresszválaszra általánosan jellemző gének („core oxidative stress response genes”) az A. nidulansban? Részt vesz-e az AtfA a szabályozásukban?
– Milyen AtfA-függő és AtfA-független stresszválasz elemek figyelhetőek meg oxidatív stressznek kitett A. nidulans tenyészetekben?
– Hogyan befolyásolja az oxidatív stressz és az AtfA transzkripciós faktor az A. nidulans szekunder anyagcseréjét?
3.2 A szénéhezésre adott stresszválasz vizsgálata az Aspergillus nidulans tenyészeteiben
A tanszék szénéhező („öregedő”, „autolizáló”) tenyészetekkel kapcsolatos vizsgálatai a 90-es évek második felében kezdődtek egy ipari jelentőségű P. chrysogenum törzzsel (Pusztahelyi és munkatársai 1997a, 1997b). Az első vizsgálatok rámutattak a szénéhezésre adott stresszválasz aktív, energiaigényes, jól szabályozott természetére és a P. chrysogenum,
illetve az A. nidulans stresszválaszának sok jellegzetes elemét – többek között az intenzív ASD-t, melanizációt, a jelentős proteináz, kitináz és γGT termelést – tárták fel (Pócsi és munaktársai 1999, Sámi és munkatársai 2001a, 2001b, Pócsi és munkatársai 2003, Sámi és munkatársai 2003, Emri és mukatársai 2004a, 2004b, 2005a). A stresszválasz szabályozásának több elemét is sikerült azonosítani (Molnár és munkatársai 2004, 2006, Emri és munkatársai 2006, 2008), köztük a FluG-BrlA útvonal jelentőségére is fény derült, ami alapján feltételeztük, hogy a konidiogenzis és a szénéhezésre adott stresszválasz között szoros kapcsolat van (Emri és munkatársai 2005a, Pócsi és munkatársai 2009). A ChiB extracelluláris kitináznak az ASD-ban betöltött szerepe szintén igazolást nyert (Pusztahelyi és munkatársai 2006, Yamazaki és munkatársai 2007, Pócsi és munkatársai 2009, Shin és munkatársai 2009). Sikerült izolálnunk egy extracelluláris proteinázt (PepJ) is, ami szénéhezés alatt a PrtA proteinázzal együtt a termelt extracelluláris proteináz aktivitás több mint felét adja (Emri és munkatársai 2009, Szilágyi és munkatársai 2011). Egy ∆prtA∆pepJ duplamutáns segítségével így igazolni tudtuk, hogy a proteinázoknak szerepe van a kleisztotéciumok képződésében (Emri és munkatársai 2018a). E vizsgálatok folytatásaként az alábbi célok elérését terveztük:
– Az A. nidulans tenyészetek transzkiptomában szénéhezés hatására végbemenő változások azonosítása; átfogó kép kialakítása a szénéhezésre adott stresszválaszról.
– Egy szénéhezés alatt szekretálódó glükanáz izolálása A. nidulans tenyészetekből; a fehérjét kódoló gén azonosítása, az enzim jellemzése, fiziológiai jelentőségének (különös tekintettel az ASD-ban betöltött szerepére) megismerése.
– Az ASD és a konidiogenezis közötti feltételezett kapcsolat (miszerint az ASD tápanyagokat biztosíthat a konidiogenezis számára szénéhező körülmények között) tesztelése felületi kultúrákban.
– A melanizáció okainak és fiziológiai szerepének feltérképezése.
– Az A. nidulansγGT-ának izolálása, a fehérjét kódoló gén azonosítása, az enzim jellemzése, fiziológiai jelentőségének (különös tekintettel a GSH anyagcserében betöltött szerepére) megismerése.
3.3 Az Aspergillus pachycristatus echinocandin toleranciájának vizsgálata
Az echinocandin típusú antifungális anyagok az eddig vizsgált valamennyi Aspergillus fajjal szemben hatásosnak bizonyultak (Chandrasekar és Sobel 2006, Calvo és munkatársai 2011, Chen és munkatársai 2011, Mukherjee és munkatársai 2011, Walter és munkatársai 2011, Calvo és munkatársai 2012). Ugyanakkor több Aspergillus faj/törzs is termel
echinocandin-típusú szekunder metabolitokat (Hüttel 2017), ami arra utal, hogy szükség esetén képesek hatékonyan védekezni ezen metabolitok antifungális hatásával szemben. Az echinocandin termelő törzsek echinocandin toleranciája nemcsak orvosi mikrobiológiai szempontból lehet érdekes (segíthet megérteni, hogyan alakulhat ki rezisztencia humán patogén Aspergillus fajokban), de ipari mikrobiológiai jelentőséggel is bír, hiszen az echinocandin tolerancia növelése fontos része lehet túltermelő törzsek előállításának. Korábbi vizsgálatainkban kimutattuk, hogy az „A. nidulans var. roseus” ATCC 58397 (NRRL 11440) törzs nem tartozik az A. nidulans fajba, inkább az A. rugulosussal rokon (Tóth és munkatársai 2011). Később e törzset egy önálló fajba az A. pachycristatusba sorolták (Matsuzawa és munkatársai 2012). Vizsgálatainkat e törzzsel végeztük és az alábbi kérdésekre kerestük a választ:
– Rendelkezik-e az ATCC 58397 törzs veleszületett echinocandin rezisztenciával?
– Hogyan védekezik e törzs a saját maga által termelt echinocandinnal szemben?
3.4 Az Aspergillus fumigatus stressz toleranciájának vizsgálata
Egy nemzetközi együttműködés keretében, a már ismert 8 Aspergillus genom mellett további 10 Aspergillus faj genomja lett megszekvenálva és annotálva (de Vries és munkatársai 2017). E munkához kapcsolódva 17 faj stressz toleranciájáról összehasonlító adatokat gyűjtöttünk (Orosz és munkatársai 2018) és rendelkezésünkre állt a gombák stressz toleranciájában bizonyítottan résztvevő gének (stresszgének) listája is (Karányi és munkatársai 2013). Ezen adathalmazok lehetővé tették számunkra az alábbi kérdések megválaszolását:
– Megjósolható-e egy gombafaj stressz toleranciája annak ismeretében, hogy milyen stresszgének fordulnak elő a genomjában?
– Hasonló-e a közeli rokon fajok stresszgén készlete és stressz toleranciája?
– Eltér-e az A. fumigatus stresszgén készlete a kisebb humánpatogén jelentőséggel bíró Aspergillus fajokétól?
Természetes élőhelyeiken a mikroorganizmusoknak nem egy-egy karakterisztikus stresszhatással kell szembenézniük, hanem többféle stressz, stresszor kombinációjával egy időben. Ez igaz az emberi szervezetbe bekerülő mikroorganizmusokra is. Elképzelhető, hogy az A. fumigatus humán patogénként mutatott sikerességét nem egy-egy stresszorral szemben mutatott kimagasló ellenálló képessége, hanem azon adottsága adja, hogy többféle stresszhez is képes hatékonyan alkalmazkodni egy időben. E lehetőség megvizsgálása érdekében az
oxidatív stresszel kombinált vaséhezés hatását tanulmányoztuk. A választásunk nemcsak azért esett erre a két stresszre, mert mindkettővel gyakran kell megbirkózniuk az emberi szervezetbe bejutó mikrobáknak, hanem mert a vastartalmú antioxidáns enzimek (katalázok, peroxidázok) oxidatív stressz elleni védekezésben mutatott jelentősége miatt várható volt, hogy e két stressz kölcsönösen befolyásolni fogja egymás hatását. Az alábbi kérdésekre kerestük a választ:
– Hogyan befolyásolja az oxidatív stressz az A. fumigatus vaséhezésre adott stresszválaszát?
– Megjósolható-e a kombinált stresszkezelésekben mutatott stresszválasz az egyszerű stresszkezelésekre adott stresszválaszok ismeretében?
– Melyek az oxidatív stresszel kombinált vaséhezésre adott stresszválasz lehetséges gyenge pontjai?