Az oxidatív stressz hatása a vaséhező tenyészetekre

A kísérleteinkben alkalmazott oxidatív stresszkezelés (3 mM H2O2; 1 h) a kontroll tenyészetek transzkriptomában (32. ábra, 21-22. táblázatok, 9-11 mellékletek) és proteomában is (Kurucz és munkatársai 2018b) csak viszonylag kis stresszválaszt generált. A transzkriptomikai adatok alapján megváltozott a szekunder anyagcsere (22. táblázat), valamint a vas transzportban fontos gének represszálódtak, de nem tapasztaltunk érdemi változást többek között az antioxidáns enzimek transzkripciós adataiban sem (21. táblázat, 9-11.

mellékletek). A vaséhező tenyészetek számára ugyanez az oxidatív stressz azonban igen komoly kihívást jelentett: Kombinált kezelés esetén lényegesen több gén (32. ábra), illetve fehérje (Kurucz és munkatársai 2018b) indukcióját és represszióját figyeltük meg, mint az önmagában alkalmazott peroxid kezelést követően. Számos, az oxidatív és hő stresszválaszra jellemző gén indukálódott (beleértve a hő stresszválaszt és az oxidatív stresszválaszt szabályozó Hsf1, Yap1 és AtfA transzkripciós faktorok génjeit is; Lessing és munkatársai 2007, Albrecht és munkatársai 2010, Hagiwara és munkatársai 2014), indukálódtak a DNS repair rendszerek, a fehérjék proteoszómális lebontásáért felelős folyamatok és a makroautofágiában fontos gének is (9. és 11. mellékletek). A DCF teszt lényegesen nagyobb redox egyensúlyvesztést mutatott kombinált kezelés esetén, mint kedvező vasellátottságú tenyészetekben (31. ábra). Sőt, a Prof. Dr. Haas és munkatársai (Medical University of Innsbruck, Innsbruck, Ausztria) által felületi tenyészetekben végzett növekedési tesztek is azt mutatták, hogy a sziderofór termelésben sérült (∆sidA) és ezért nem megfelelő vasellátottságú törzsek oxidatív stressz érzékenysége nagyobb volt, mint a kontroll törzseké (Kurucz és munkatársai 2018b). Az A. fumigatus viselkedésével összhangban a sziderofórtermelés inaktiválása (∆nps6) a Cochliobolus heterostrophus oxidatív stressz érzékenységét is megnövelte (Oide és munkatársai 2006).

A vaséhezés oxidatív stressz érzékenységet növelő hatása nem magától érthetődő, hiszen élesztő fajokban a szénéhezés például kifejezetten csökkenti az oxidatív stresszel szemben mutatott érzékenységét (Roetzer és munkatársai 2011). Megfigyeléseink alapján nem meglepő, hogy a patogén mikrobák ROS-okal való támadása és egyúttal az

életfolyamataikhoz szükséges vas elvonása elterjedt stratégia az állatvilágban a fertőzések leküzdésében (Nairz és munkatársai 2014, Prüfer és munkatársai 2014). A humán polimorfonukleáris leukociták például nemcsak ROS, de a vasat megkötő laktoferrin termelésük révén is gátolják a gombák növekedését (Zarember és munkatársai 2007, Prüfer és munkatársai 2014).

A kombinált stresszkezelés (-Fe/+H2O2 vs. +Fe/-H2O2) hatása nemcsak erősségében, de jellegében is eltért az egyszerű stresszkezelésekétől és nem fogható fel a kétféle kezelésre (+Fe/+H2O2 vs. +Fe/-H2O2, illetve -Fe/-H2O2 vs. +Fe/-H2O2) adott stresszválasz kombinációjaként. A megfigyelt transzkripcionális változások túlnyomó többsége csak a kombinált kezelést követően volt detektálható (33. ábra).

33. ábra A vashiányos és a kontroll A. fumigatus tenyészetek oxidatív stresszválaszai (-Fe/+H2O2vs. -Fe/-H2O2, illetve +Fe/+H2O2 vs. +Fe/-H2O2) közötti átfedés

A színek a kizárólag a +Fe/+H2O2vs. +Fe/-H2O2 összehasonlításban (kék), a kizárólag a -Fe/+H2O2vs.

-Fe/-H2O2 összehasonlításban (sárga), valamint a mindkét összehasonlításban (rózsaszín: mindkét összehasonlításban indukálódott, vagy represszálódott; piros: egyik összehasonlításban indukálódott, a másikban represszálódott) stressz-függő gének százalékos megoszlását mutatják. Stressz-függő gén: A legalább kétszeres transzkripciós változást (│log2 FC│ > 1) mutató, differenciáltan expresszálódott gén.

Kevés irodalmi adat áll rendelkezésre a többféle stresszkezelés együttes hatásáról. Az A.

fumigatus esetében a gliotoxin és a H2O2 együttes hatását tanulmányozták a proteom változására és szintén számos, csak a kombinált kezelésre jellemző változást tapasztaltak (Owens és munkatársai 2014). A C. albicans esetében szintén leírták, hogy a szénforrás (szénforrás limitációs stressz) alapvetően befolyásolja a gomba stressztűrő képességét (Brown és munkatársai 2014). A laboratóriumi körülmények között végzett, egyszerű stresszkezelésekre adott stresszválaszok igen sokat elárulnak a gomba lehetséges stresszválasz elemeiről és ezek kifejeződésének szabályozásáról. A természetes niche-ekben, így az emberi szervezetben is azonban, jellemzően egyszerre többféle stressz éri/érheti a gombákat. Az itt

84.6

6.6 5.8

2.8

bemutatott saját és az említett irodalmi adatok is felhívják a figyelmet arra, hogy a

„klasszikus” stresszválasz kutatások eredményei alapján nem jósolható meg a gomba viselkedése egy komplex környezetben. Ez egyben felértékeli azon erőfeszítéseket is melyek célja, hogy a gombák stresszválaszait közvetlenül a kutatás szempontjából releváns környezetben (pl. az emberi szervezetben) tanulmányozzuk (McDonagh és munkatársai 2008).

A transzkriptom változásai alapján az alábbi folyamatok segíthették a tenyészeteket, hogy túléljék a kombinált kezelést:

1. Vas-független antioxidáns enzimeket kódoló gének indukciója.

A kombinált stresszkezelés hatására 16 ismert, vagy feltételezett antioxidáns enzimet kódoló gén indukálódott, noha önmagában az oxidatív stressz egyet sem, míg a vaséhezés csak egy gént indukált (11. melléklet). Ráadásul a 16 gén közül 5 vaséhezés alatt repressziót mutatott (11. melléklet). E gének túlnyomó többsége működéséhez vasat nem igénylő enzimet (pl. a tioredoxin-glutaredoxin rendszer enzimei, SODok) kódol (11. melléklet). A proteomikai vizsgálatok a Sod1 (CuZn-SOD), a Trr1 (feltételezett TrxR) és az Afu2g14960 (feltételezett GR) fehérjék mennyiségének növekedését igazolták (Kurucz és munkatársai 2018b). A vas-független antioxidáns enzimgének indukciója mellett számos, a ROS-ok okozta károk mérséklésében potencionálisan fontos rendszer (pl. DNS repair, hőstresszválasz elemek, a károsodott fehérjéket eltávolító folyamatok) is indukálódott (9. melléklet).

2. A fehérjeszintézis repressziója.

A riboszómák biogenezisében és a transzlációban fontos gének nagy számban represszálódtak nemcsak a kontroll, de a vaséhező tenyészetekben mért transzkripciós értékekhez képest is (9. melléklet). E folyamatok gátlása a növekedés gátlásán keresztül nemcsak anyagokat/energiát takarít meg a sejtek számára (Gasch 2003), de mérsékelheti a sejtek vasigényét is.

3. A vas ionokat biztosító folyamatok aktiválódtak

A sziderofór anyagcserében fontos gének jelentős része a kombinált kezelés alatt is indukciót mutatott, igaz, a vaséhező tenyészetekhez képest (-Fe/+H2O2 vs. -Fe/-H2O2) ez az indukció nem volt számottevő (21. táblázat, 9-11. mellékletek). Ezzel szemben a három RIA gént a kombinált kezelés egyértelműen indukálta a vaséhező tenyészetekben mért transzkripciós értékekhez képest is (11. melléklet).

Richie és munkatársai (2007a) kimutatták, hogy tápanyag limitáció alatt a makroautofágia fontos része a vas homeosztázis fenntartásának az A. fumigatus fonalas gombában. Minthogy a makroautofágiához köthető gének – a fehérjék proteoszómális lebontásában fontos génekkel együtt – indukálódtak a kombinált strsszkezelés alatt (9.

melléklet), így elképzelhető, hogy a vastartalmú fehérjék lebontása és vastartalmuk hasznosítása szintén fontos eleme a rendelkezésre álló vas hatékony (újra)elosztásának a vasigényes folyamatok között. E tekintetben az oxidatív stresszel kombinált vaséhezés a szénéhezésre emlékeztet. Szénéhezés alatt a sejtek részben a tápközegben még jelenlévő szénforrásokat (pl. az elpusztult sejtek sejtfala) próbálják meg extracelluláris enzimeik segítségével hasznosítani, részben a makroautofágia segítségével jutnak lebontható szerves anyagokhoz (Szilágyi és munkatársai 2013, van Munster és munkatársai 2016).

4. Sok vastartalmú fehérje génje indukálódott

Bár a kombinált stresszkezelés alapvetően represszálta a vas-függő folyamatokat (pl.

kataláz-peroxidáz gének, légzés, citromsav ciklus, ergoszterin szintézis, FeS klaszter fehérjék, hem-tartalmú fehérjék génjei), jelentős számban voltak olyan gének is, amelyek indukciót mutattak (10-11. mellékletek). Összesen 50, vas felhasználáshoz szorosan köthető indukálódott gént találtunk kombinált stressznek kitett tenyészetekben, míg vaséhezés esetén 19, oxidatív stresszt követően pedig 5 ilyen típusú gént azonosítottunk (10-11. mellékletek). E gének közül külön említést érdemel a 11 FeS klasztert tartalmazó fehérje génje, valamint a 6 FeS klaszter bioszintézisben fontos gén, hiszen a vaséhezés önmagában e két géncsoport génjei közül egyet sem indukált (10. melléklet). Fontos megjegyezni, hogy e változások csak a transzkripció szintjén lettek megfigyelve, a proteomikai vizsgálatok egyetlen esetben sem mutattak ki indukciót (Kurucz és munkatársai 2018b). A FeS klaszter fehérjék igen érzékenyek az oxidatív stresszre; oxidatív stressz alatti folyamatos újra szintézisük fontos eleme az oxidatív stresszválasznak (Rouault és Klausner 1996, Imlay 2006). Vas hiány esetén azonban a szintézis komoly nehézségekbe ütközik (Rouault és Klausner 1996, Imlay 2006).

Elképzelhető, hogy a kérdéses gének transzkripcionális aktiválása abban segít, hogy a rendelkezésre álló vas hatékonyabban tudjon a vastartalmú fehérjékbe beépülni. Ez azonban nem jelenti szükségszerűen e fehérjék mennyiségének a növekedését, de hozzájárulhat ahhoz, hogy mennyiségük ne csökkenhessen le túlságosan. A vastartalmú fehérjék mennyiségének, illetve a vasfüggő folyamatok aktivitásának legalább egy minimális szinten történő biztosítása kulcsfontosságú lehet a vaséhezéssel kombinált oxidatív stresszválasznak. Bár a FeS klaszter és hem bioszintézis útvonalak erősen konzerváltak (Kroll és munkatársai 2016, Braymer és Lill 2017), az A. fumigatus vas anyagcseréjének megzavarása FeS klaszter bioszintézist, illetve hem bioszintézist gátló anyagokkal (Ben Yaakov és munkatársai 2016, Choby és munkatársai 2016, Tripathi és munkatársai 2017) ígéretes kiindulási pontja lehet új antifungális szerek/stratégiák kidolgozásának.

5.4.2.2 A stressz hatása az A. fumigatus néhány, terápiás szempontból is fontos