A TLR2, TLR3 és TLR4 expressziójának vizsgálata krónikus gyulladásos bélbetegségben szenvedı (IBD-s) gyermekek kolon

nyálkahártyájában (199)

Vizsgálatunkban elsıként elemeztük a természetes immunitásban fontos TLR2, TLR3 és TLR4 expressziót frissen kórismézett (fd) IBD-s, kezelt, relapszusban lévı (r) IBD-s és kontroll gyermekek kolon nyálkahártyájában. Új adataink értékét az is növeli, hogy a frissen kórismézett betegek kezelést nem kaptak, vagyis az immunszuppresszió alkalmazása nem befolyásolta az eredményeket. Másrészt ugyanabban az egyénben a kóros-gyulladt és makroszkóposan ép mukózát is elemeztük. Ez a mintavételi módszer azért volt fontos, mert az adott IBD-s betegbıl a 2 különbözı minta (gyulladt és nem gyulladt), értelemszerően ugyanabban a genetikájú egyénben, ugyanolyan környezeti tényezık, táplálkozás melletti mintavételt jelentette.

Vizsgálatainkban a TLR2 és TLR4 mRNS és fehérje expresszió szignifikánsan fokozódott mind az fdIBD-s, mind az rIBD-s gyermekek kolon nyálkahártyájának gyulladásban lévı szakaszán a kontrollokhoz képest. Mindkét aktív IBD-s populációban a gyulladt- és nem gyulladt területek hasonló mértékben expresszálták a TLR-eket. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a TLR2 és TLR4 fontos-, de nem iniciáló szerepet töltenek be az IBD patomechanizmusában.

Állatkísérletek alapján ismert, hogy a TLR4 mutáns (C3H/HeJBir) és TLR4 hiányos egerek fokozottan érzékenyek a dextrán-szódium-szulfát (DSS) indukált kolitiszre, a vad típusúakhoz

megfelelı TLR4 mőködés, hiszen a kommenzális baktériumok által közvetített védelem jelentısen meggyengül a TLR4 csökkent mőködésekor (263). Az intesztinális epiteliális barrier védelmében a kommenzális baktériumok által indukált TLR2 jelátvitel is szerepet játszhat, bár - ellentétben a TLR4-gyel - a TLR2 csökkent funkciója önmagában nem növeli az epiteliális permeabilitást (264).

A TLR-ek expresszióját IBD-s gyermekekben korábban még nem vizsgálták, felnıttekben is csak néhány közlemény ismert. Elke Cario E és munkatársai már kezelt, felnıtt IBD-s betegek és kontrollok terminális ileum-, valamint kolon biopsziás mintáiban határozták meg a TLR2-TLR5 expressziót (265). A TLR4 fehérjeszint az IBD-s betegek kolon nyálkahártyájának gyulladásban lévı- és gyulladásban nem lévı szakaszán is megemelkedett, míg a TLR2 és TLR5 fehérjeszint változatlan maradt a kontrollokhoz viszonyítva. A TLR3 fehérjeszint a CD-s kolon nyálkahártyájának gyulladásban lévı- és gyulladásban nem lévı szakaszán is csökkent, míg UC-ban változatlan maradt a kontrollokhoz képest.

Eredményeink részben korrelálnak ezekkel az adatokkal, hiszen az IBD-s gyermekek kolon nyálkahártyájának gyulladásban lévı szakaszán mi is magasabb TLR4 fehérjeszintet detektáltunk. Ellenben az IBD-s gyermekek kolon nyálkahártyájának gyulladásban nem lévı szakaszán a TLR4 fehérjeszint nem tért el a kontrollokétól. Továbbá az IBD-s gyermekek kolon nyálkahártyájának gyulladásban lévı szakaszán magasabb TLR2 fehérjeszintet igazoltunk, ami szintén ellentétes Cario és munkatársainak adataival. A különbségek adódhatnak a betegek eltérı életkorából (felnıttek/gyermekek), az eltérı kontroll csoportból (polipektómián, rákszőrésen résztvevık/bélvérzés, székrekedés miatt vizsgált), illetve metodikai okokból.

Egy másik, szintén felnıtt IBD-s populációban TLR1-TLR5 expressziót vizsgáltak szigmoid divertikulitiszes betegeket kontrollokkal összehasonlítva (266). A kontrollok kolon nyálkahártyájában nem tudtak kimutatni TLR1-TLR5 expressziót. A TLR2, TLR4 és TLR5 expresszió gyulladásfüggıen indukálódott és expresszálódott a kolon intramukózális makrofágjaiban. Eredményeink korreláltak ezekkel az adatokkal, hiszen a TLR2 és TLR4 gyulladásfüggı expresszióját a kolon mukózában mi is igazoltuk.

A harmadik vizsgálatban szintén felnıtt IBD-s betegek kolon nyálkahártya dendritikus sejtjeinek (DC) TLR2 és TLR4 fehérjeszintjét vizsgálták FACS-al (267). Az egészséges kontrollok mukózális DC-i csak kis mennyiségben expresszáltak TLR2-t és TLR4-et, míg IBD-ben mindkét TLR expresszió szignifikánsan emelkedett, hasonlóan a mi eredményeinkhez. Ebben a közleményben nem találtak összefüggést a betegek immunszuppresszív kezelése (AZA) és a TLR pozitív DC-k száma között, bár a szerzık nem

tértek ki arra, hogy az IBD-s betegek remisszióban, vagy relapszusban voltak-e a biopszia vételének idıpontjában.

Az IBD-ben kimutatott fokozott TLR2 és TLR4 expresszió kialakulására az egyik lehetséges magyarázat, hogy az epiteliális barrier károsodása következtében a bélnyálkahártya sejtjei nagyobb mértékben érintkeznek a luminális bakteriális antigénekkel és ez vezet a TLR-ek fokozott expressziójához (266). Másfelıl korábbi vizsgálatok igazolták, hogy a bakteriális komponensek mellett bizonyos citokinek és nekrotizáló sejtkomponensek is módosíthatják a TLR-ek expresszióját. Ezek az INFgamma és a TNFalfa, melyek jelentıs patofiziológiai szerepet töltenek be az IBD kialakulásában, mivel fokozzák a mukózális epiteliális sejtek TLR4 expresszióját (268,269). Hasonló folyamatok játszódnak le hipoxiás körülmények között is: vese iszkémiás károsodásakor a renális epiteliális sejtek TLR2 és TLR4 mRNS expressziójának fokozódása INFgamma és TNFalfa hatására következik be (270).

Figyelemre méltó az a közelmúltban megjelent publikáció, ahol Bechet-kórban elemezték a NOD2 és a TLR expressziót (271). A kórkép azért érdekes, mert a klinikai kép nagyon hasonló lehet IBD-hez (hasfájás, fogyás, véres széklet, izületi fájdalom, izületi gyulladás), sokszor differenciáldiagnosztikai problémát jelentve a mindennapi gyakorlatban. Ebben a vizsgálatban Bechet-kóros betegekben a NOD2 és a TLR2, TLR4 mRNS expresszió szignifikánsan fokozott volt a kontrollhoz képest. A TLR2 és TLR4, valamint a NOD2 szinergista módon fokozta a proinflammatórikus citokinek (Th1) expresszióját, amit a fokozott T-bet mRNS megjelenés is jelzett.

Egy másik vizsgálatban Bechet-kóros betegek perifériás vérének sejtjeit (PBMC) és intesztinális mukózáját párhuzamosan elemezték (272). Itt is, hasonlóan a mi eredményünkhöz, csak az érintett lézióban találtak fokozott TLR2 és TLR4 expressziót. A sejtes elemek közül a CD68 és a TLR2 pozitív makrofágok töltötték be a legfontosabb szerepet a Th1 irányba generált citokinek termelésével és indukciójával, melyben központi szerepe az általuk termelt IL12-nek volt. Kiemelésre érdemes, hogy a TLR2 ligandja a PBMC-k felszínén és az intesztinális mukózában is a HSP60 volt.

IBD-s gyermekekben a TLR expresszió vizsgálatáról publikált közleményünk megjelenése óta az elmúlt években számos tanulmány és citáció született, melyek igazolták, hogy a fokozott TLR expresszió elısegíti a mikrobiális produktumok felismerését és fokozza a velük szemben kialakuló immunválaszt (273,274). A mikrobiális termékek és citokinek által aktivált TLR-eken keresztül a CD40 expresszió fokozódik az IBD-s betegek gyulladásban lévı mukózájában (275,276). A CD40/CD40L interakció a dendritikus sejtekben Th1 irányú

citokinválaszt generál (TNFalfa, IL1, IL6, IL8), amely fontos szerepet játszik az IBD patogenezisében (277,278).

Részleteiben nem ismert viszont, hogy a fokozott TLR2 és TLR4 expresszió mennyiben tölt be központi szerepet az IBD patomechanizmusában. Mennyiben tekinthetı iniciatív faktornak és mennyiben csak egy következményes, gyulladással kapcsolatos jelenségnek?

Vizsgálataink alapján, miszerint a frissen kórismézett és a kezelt, de relapszusban levı betegekben a mukózális TLR2 és TLR4 egyaránt magas volt, továbbá a makroszkóposan nem érintett IBD-s mukózán megjelenı expresszió a kontrollhoz hasonló volt, arra utal, hogy a TLR inkább a gyulladás elmélyítésében tölt be fontos szerepet, a korábban leírtak szerint (mukózális károsodás, permeábilitás növekedés).

Más vélemények szerint gyulladásos mediátorok hatására TLR pozitív DC-k vándorolnak újonnan a vérbıl a gyulladásban lévı mukózába és ez vezet a fokozott TLR expresszióhoz (279). Ennek az elméletnek ellentmond, hogy a gyulladt bélnyálkahártya intesztinális DC sejteiben nem tudtak kimutatni fokozott TLR1 és TLR3 expressziót (266).

Akár primer, akár szekunder szerepet játszik a TLR az IBD patomechanizmusában, az biztos, hogy fontos tényezı, és a jövıben akár terápiás cél („target”) is lehet, hasonlóan az anti-TNFalfa terápiához. Korábban alapkutatások igazolták, hogy a anti-TNFalfa fontos szerepet játszik IBD-ben. Bár nem csak ebben a kórképben fontos, és nem kiváltó tényezı, az elmúlt másfél évtizedben mégis óriási sikert és elırelépést jelentett az anti-TNFalfa terápia az IBD kezelésében (280,281).

Eredményeinket összefoglalva megállapítható, hogy a fokozott TLR2 és TLR4 expressziónak szerepe van az IBD patogenezisében. Azonban az a tény, hogy a TLR2 és TLR4 expresszió csak a gyulladt mukózában volt emelkedett, arra utal, hogy szerepük nem elsıdleges, azaz nem a betegség kiváltásáért felelısek, hanem másodlagos, vagyis a betegség fenntartásában játszanak szerepet.

VIII.1.6. Az iAP expressziójának vizsgálata gyulladásos bélbetegségben szenvedı