Az endokrin pankreász működésének vizsgálata PARP-2 -/- egerekben

Bár a PARP-2^-/- egerek inzulinérzékenysége javuló tendenciát mutatott, a glükóz érzékenység azonban meglepő módon romlott (24A ábra), ami a glükóz-indukált inzulin felszabadulás zavarára volt visszavezethető (24B ábra). A PARP-2^-/- egerek pankreászában normál (chow) tápon nem tapasztaltunk változást, azonban HFD adása esetében a PARP-2 -/-egerek béta-sejtjei nem voltak képesek hiperpláziával kompenzálni az emelkedő inzulin iránti igényt. Vagyis a PARP-2^-/- egerek szigetszerve HFD adása esetén nem nőtt meg, amire a

pankreász súlyának változásából, szövettani és biokémiai vizsgálatokból következettünk (24C-G ábra). Fontos megjegyezni, hogy a PARP-1 deléciója nem okozott hasonló változásokat a szigetszerv működésében (24H és 24I ábra).

24. ábra A PARP-2 deléciója az endokrin pankreász diszfunkcióját okozza.

(A-B) PARP-2^+/+ és PARP-2^-/- egereken (n=7/9) (A) a glükóz érzékenység jellemzésére OGTT vizsgálatot végeztünk el, eközben (B) vért gyűjtöttünk, amiből szérum inzulin szintet határoztunk meg. Meghatároztuk az egerek pankreászának (C) súlyát, (D-E) inzulin immunfestéssel a szigetszerv méretét és morfológiáját (a vonal 50 µm-t jelez), (F) savas extrakció után a pankreász inzulin tartalmát és (G) az inzulin szekréció kulcsgénjeinek az expresszióját. (H-I) PARP-1^+/+ és PARP-1^-/- egerek (n=3/3) pankreászában (H) inzulin immunfestést végeztünk (a vonal 50 µm-t jelez), illetve (I) savas extrakció után meghatároztuk az inzulin tartalmat.

Aktin

25. ábra. A PARP-2 deléciója a pankreászban a SIRT1 fehérje mennyiségének és a SIRT1 aktivitásának emelkedéséhez vezet

Mivel a feltárt fenotípus abból adódik, hogy a pankreász béta-sejtjei nem képesek a proliferációra, úgy gondoltuk, hogy egy, a béta-sejtek proliferációjához szükséges transzkripciós faktor diszfunkciója lehet a fenotípus oka. A pankreatikus-duodenális homeobox-1 (PDX1) acetilált állapotban működő fehérje, amelynek megfelelő működése elengedhetetlen a béta-sejt proliferációhoz. A PARP-2^-/- egerek pancreasában a PDX1 expressziója alacsonyabb volt, mint vad típusú társaikban (24G ábra), míg a SIRT1 mRNS mennyisége és fehérje expressziója magasabb volt (25 ábra). A SIRT1 deacetilálja és aktiválja a FOXO1 enzimet, ami a PDX1 expresszió csökkenéséhez és a hiperplasztikus válasz elmaradásához vezet (Kitamura és mtsai, 2002), ami esetünkben is lehetséges magyarázat.

A PARP-1 knockout egereken végzett kísérletsorozathoz hasonlóan megvizsgáltuk a SIRT2 és SIRT3 aktivitásának változását a PARP-2 deléciója esetén is. Sem a harántcsíkolt izomban (26A ábra), sem a májban (26B ábra) nem változott a SIRT2 és SIRT3 célfehérjék acetiláltsága.

Itt szeretném kiemelni, hogy az alkalmazott metabolikus modellekben nem tapasztaltuk a DNS törések akkumulációját a PARP-2 deléciója során (26C ábra). Ehhez hasonlóan a PARP-1 deléciója sem vezetett a DNS törések számának növekedéséhez (nem közölt eredmény).

26. ábra. A PARP-2 deléciója nem befolyásolja a SIRT2 és a SIRT3 aktivitását, illetve nem vezet a DNS hibák akkumulációjához

(A-B) Az (A) m. gastrocnemiusban és a (B) májban immunprecipitációs kísérletekben vizsgálatuk a SIRT2 szubsztrát tubulin és a SIRT3 szubsztrát Ndufa9 acetiláltságát. (C) A m.

gastrocnemiusban TUNEL assay-vel vizsgáltuk a DNS törések jelenlétét.

Ashraf, 2002, Yen és mtsai, 1996). Jól ismert jelenség, hogy a PARP-1 deléciója, vagy farmakológiai gátlása véd az oxidatív stresszel jellemezhető patológiás állapotok ellen (Virag és Szabo, 2002). Az előzőekben bemutatott eredményeink arra utaltak, hogy a PARP-2 deléciója, vagy depléciója felszabadítja a SIRT1 promóterét a represszió alól és a megemelkedő SIRT1 aktivitás a mitokondriális biogenezis indukciójához vezet – vagyis a PARP-2 deléciója védelmet nyújthat az oxidatív stressz-indukált sejtelhalás ellen.

Ezt az elméletet akut doxorubicin (DOX)-indukált vaszkuláris károsodás modellben próbáltuk ki. A doxorubicin egy ciklikus kinon-szemikinon átalakuláson keresztül gyökök képződéséhez vezet, amelyek károsítják – többek között – a kardiovaszkuláris rendszert (Davies és Doroshow, 1986, Doroshow és Davies, 1986). A modellben az egerek egyszeri 25 mg/kg doxorubicin dózist kapnak, ami után pár nappal megjelennek a kardiovaszkuláris rendszer károsodását jelző markerek (Bai és mtsai, 2004, Pacher és mtsai, 2003). Ismert, hogy a doxorubicin kezelés a szívben PARP aktivációt okoz és a PARP-1 deléciója kardioprotektív hatású (Pacher és mtsai, 2002).

PARP-2^+/+ és PARP-2^-/- egereket kezeltünk 25 mg/kg DOX-szal, vagy vehikulummal (VEH, fiziológiás sóoldat) és a kezelés után két nappal megvizsgáltuk az aorták kontraktilitását norepinefrin, 5-hidroxi-triptamin (szerotonin) és KCl hatására. Bár a vehikulum kezelt PARP-2^+/+

és PARP-2^-/- egerek ereinek kontraktilitása között nem találtunk különbséget, a DOX kezelés mindhárom vazokonstriktor anyag hatását rontotta, ami ellen a PARP-2^-/- egerek részleges védelmet élveztek (27A-C ábra). Nem befolyásolta az acetilkolin vagy külső NO donor által indukált vazorelaxációt a PARP-2 deléciója (27D-E ábra). A KCl koncentráció változtatása a simaizom sejtek depolarizálásán keresztül okoz érösszehúzódást, vagyis a PARP-2^-/- egerek részleges védettsége (27C ábra) a simaizom sejtek érintettségére utal. Ezt ellenőrzendő simaizom aktinra (SMA) specifikus antitesttel, ami a simaizom sejtek markere, megfestettük a kísérletben részt vevő állatok aortáját (27F ábra) és azt tapasztaltuk, hogy a simaizom marker jele lecsökken a PARP-2^+/+ egerek aortájában, ami az előző eredményekkel összhangban a simaizom sejtek pusztulására utal két napos DOX kezelés után, amit a PARP-2 hiánya részlegesen kivéd.

27. ábra. A PARP-2 deléciója védelmet nyújt a DOX vaszkulatúrát károsító hatása ellen PARP-2^+/+ és PARP-2^-/- egereket kezeltünk vehikulummal, vagy DOX-szal (PARP-2^+/+ CTL n=10, PARP-2^-/- CTL n=7, PARP-2^+/+ DOX n=8, PARP-2^-/- DOX n=8), majd az állatok aortáit vizsgáltuk két nappal a kezelés után. Az érgyűrűk kontraktilis válaszát (A) norepinefrin, (B) 5-hidroxi-triptamin és (C) KCl kumulatív adásával izometrikus kontraktilis erőmérő apparátus segítségével határoztuk meg. A dilattatív válasz vizsgálatához az érgyűrűket norepinefrinnel előfeszítettük, majd emelkedő koncentrációban (D) acetilkolinnal és (E) nátrium-nitroprussziddal kezeltük. (F) Az aortákon formalinos fixálást és paraffinba történő beágyazást követően SMA festést végeztünk. Lu –érlumen

A DOX által termelt gyökök DNS töréseket hoznak létre, ami PARP aktivációhoz vezet és a sejtek NAD⁺ és ATP készletét elhasználva sejthalált indukál (Bartha és mtsai, 2011, Mizutani és mtsai, 2005). A PARP-1 deléciója vagy a PARP gátlás a NAD⁺ és ATP készlet elhasználását akadályozza meg (Virag és Szabo, 2002). A PARP-2 deléció esetében is felmerül, hogy hasonló módon fejti ki védő hatását. A további kísérleteinket PARP-2^+/+ és PARP-2^-/- egereken, illetve MOVAS (egér aorta simaizom) sejteken végeztük el. A MOVAS sejtekben shRNS technikával

28. ábra A PARP-2 deléciója nem befolyásolja érdemben a sejtek össz-PARP aktivitását és nem a NAD⁺ szint csökkenésének megakadályozásán keresztül fejti ki védő hatását.

(A) PARP-2^+/+ és PARP-2^-/- egerek (n=10/7/8/8) aortáiban TBARS assay-vel jellemeztük a szabadgyök termelést. (B) scPARP-2 és shPARP-2 MOVAS sejtekben (n=3/3) hidroetidin festéssel határoztuk meg a DOX által indukált szuperoxid gyök termelést. (C-D) A DNS töréseket TUNEL assay-vel mutattuk ki (C) PARP-2^+/+ és PARP-2^-/- egerekben, illetve (D) scPARP-2 és shPARP-2 MOVAS sejtekben. (E) PARP-2^+/+ és PARP-2^-/- egerek aortáiban a PARP aktivitást anti-PAR immunhisztokémiával mutattuk ki. (F-G) scPARP-2 és shPARP-2 MOVAS sejtekben (n=3/3) (F) ³H-NAD⁺ beépülésével határoztuk meg az össz-PARP aktivitást, illetve (G) kolorimetriás assay-vel a NAD⁺ koncentrációt. Lu – érlumen.

Feltételeztük, hogy a PARP-2 deléciója az előzőekben leírtakhoz hasonlóan a SIRT1 indukciójához vezet és ezen keresztül a mitokondriális funkció stabilizálásához. Mind az aortában, mind a MOVAS sejtekben a PARP-2 deléciója a SIRT1 mennyiségének növekedést eredményezett (29A és 29B ábra) hasonlóan az eddig vizsgált modellekhez. A SIRT1

promóterének ^-1-^-91 régióját tartalmazó konstrukt az shPARP-2 MOVAS sejtekben magasabb aktivitást mutatott, mint a kontroll scPARP-2 MOVAS sejtekben (29C ábra). ChIP technika segítségével kimutattuk a PARP-2 jelenlétét a SIRT1 promóterén (29D ábra).

29. ábra A PARP-2 deléciója a simaizomban is a SIRT1 expresszió emelkedését okozza.

(A) scPARP-2 és shPARP-2 MOVAS sejtekben (n=3/3) RT-qPCR technikával meghatároztuk a SIRT1 expressziót. (B) PARP-2^+/+ és PARP-2^-/- egerek (n=10/7/8/8) aortájában Western blot segítségével határoztuk meg a SIRT1 fehérje mennyiségét. (C) A SIRT1 promóterének ^-1 - ^-91 darabját tartalmazó luciferáz riporter konstrukt felhasználásával megmértük scPARP-2 és shPARP-2 MOVAS sejtekben a PARP-2 deléciójának hatását a promóter aktivitására. (D) ChIP kísérletekben jellemeztük a PARP-2 jelenlétét a SIRT1 promóter ^-1-^-91 szakaszán scPARP-2 és shPARP-2 MOVAS sejtek (n=3/3) felhasználásával.

A SIRT1 expresszió fokozódása más szervekben (pl. harántcsíkolt izom, máj) a mitokondriális biogenezis fokozódásával járt, ezért megvizsgáltuk az aortában is a mitokondriális aktivitás mértékét. Az aortában fokozódott a mitokondriális DNS mennyisége (30A ábra) és több, a mitokondriális oxidációhoz szükséges gén (FOXO1, ATP5g1, ndufa2, ndufb5) expressziója is (30B ábra). Fontos megjegyezni, hogy bár DOX kezelés hatására csökken a fenti mitokondriális markerek (FOXO1, ATP5g1, ndufa2, ndufb5) expressziója, a PARP-2 deléciója esetén ezeknek a géneknek az expressziója magasabb maradt, mint a DOX kezelt kontroll állatokban mért érték.

30. ábra. A PARP-2 deléciója védi a mitokondriumot a DOX kiváltotta károsodással szemben

(A-B) PARP-2^+/+ és PARP-2^-/- egerek aortájában (n=10/7/8/8) meghatároztuk (A) a mitokondriális DNS tartalmat, illetve (B) több, a mitokondriális funkcióhoz szükséges gén expresszióját. (C-D) scPARP-2 és shPARP-2 MOVAS sejtekben (C) megmértük a mitokondriális DNS mennyiségét (n=3/3), míg (D) az XF96 készülék segítségével meghatároztuk a sejtek oxigén fogyasztását (n=46/46).