A PARP gátlás metabolikus hatásai

Az eddigi eredmények arra utalnak, hogy a PARP-1 depléciója a NAD⁺ szint emelkedéséhez és a SIRT1 indukciójához vezet, ami a mitokondriális biogenezist aktiválja. A PARP-1 felelős a sejtek PARP aktivitásának 85-90%-ért (Schreiber és mtsai, 2002), illetve a PARP-1 gyors és hatékony NAD⁺ fogyasztó (Ame és mtsai, 1999) ezért aktivitásának gátlása megemelheti a NAD⁺ szintet („NAD⁺ spórolás”). Logikusan adódik a kérdés, hogy PARP inhibitor adása hasonló fenotípust alakít-e ki, mint a PARP-1 deléciója.

Izomrostokká differenciált C2C12 mioblasztokat kezeltünk 1 µM PJ34 PARP inhibitorral (Soriano és mtsai, 2001). A PARP-1 aktivációja H2O2-vel gátolja a SIRT1 aktivitást és csökkenti a NAD⁺ szintet (8A-C ábra), ami ellen a PJ34 kezelés védelmet nyújt.

A B C

8. ábra. Az oxidatív stressz PARP függő módon gátolja a SIRT1 aktivációt

C2C12 sejteket H2O2-vel kezeltük PJ34 előkezelés mellett, vagy anélkül, majd meghatároztuk (A) a PARP-1 és PAR szinteket, (B) a NAD⁺ mennyiségét, illetve (C) a SIRT1 aktivitást.

A PJ34 gátolta a PARP-1 aktivitást (9A ábra), ezzel párhuzamosan idő- (9B ábra) és dózisfüggő (9C ábra) módon a NAD⁺ szint emelkedését okozta, illetve aktiválta a SIRT1 enzimet (9D ábra), azaz hasonlóan működött, mint a PARP-1 genetikai inaktiválása. A SIRT1 expresszió nem változott PJ34 kezelés hatására (9D és 9E ábra). A SIRT1 deléciója, vagy csendesítése felfüggesztette a PJ34 hatását (9D és 9E ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a PARP aktivitás gátlása is a PARP-1 deléciójához hasonlóan a NAD⁺ szint emelésén keresztül a SIRT1 aktivációját okozzák. Ezzel párhuzamosan kizártuk annak a lehetőségét, hogy a SIRT1 PARilációja okozza a SIRT1 aktivitásban kimutatott változást (9F ábra). A PJ34 a SIRT1 aktiváción keresztül tehát a mitokondriális biogenezis indukciójához vezet, amit a mitokondriális gének (Ndufa2, Ndufa3, MCAD és PDK4) expressziójának és a sejtek oxigénfogyasztásának emelkedése jellemzett (9G és 9H ábra).

SIRT1 shRNS és a SIRT1 knockout MEF-ek segítségével bizonyítottuk, hogy a metabolikus változások SIRT1 függőek (9D, 9F-H ábra), bár vannak SIRT1 független hatások is, mint az UCP3 indukció (9G ábra). A SIRT1 aktiváció hatására az útvonal SIRT1-től lefelé helyeződő elemei is aktiválódnak. Például jelentősen megnő a PGC1α kötődése a SIRT1 függő promóterekhez (pl. PDK4 promótere) (9I ábra). Ezzel ellentétben a HA antitest jele (i.e. a PGC1α jelenléte) nem változott az UCP3 promóterén, amely SIRT1-független módon indukálódott (9I ábra).

9. ábra. A PARP-1 farmakológiai gátlása a SIRT1 aktivitás emelkedéséhez vezet C2C12 sejtekben

C2C12 sejteket PJ34-gyel (1 µM) kezeltük, majd meghatároztuk (A) a PARP-1 és a PAR szintjét, (B) a NAD⁺ mennyiségének időbeli változását, illetve (C) a NAD⁺ mennyiségének és a SIRT1 aktivitásának változását a PJ34 koncentrációjának függvényében. (D) SIRT1^+/+ és SIRT1^-/- MEF sejtekben, illetve (E) SIRT1 csendesített C2C12 sejtekben meghatároztuk a SIRT1 fehérje mennyiségét és a SIRT1 aktivitását. (F) FLAG-HA-PGC-1α-t overexpresszáló C2C12 sejtek lizátumából az ábrán megjelölt antitestekkel immunprecipitációt végeztünk el, majd anti-PAR antitesttel vizsgáltuk az ábrán megjelölt fehérjék anti-PARilációját. (G-I) PJ34 kezelt C2C12 sejteket kontroll (nem specifikus), vagy SIRT1 specifikus shRNS-sel kezeltünk, majd meghatároztuk (G) több, a mitokondriális biogenezishez szükséges gén expresszióját és (H) a sejtek oxigén fogyasztását. (I) PJ34 kezelt C2C12 sejtek felhasználásával ChIP kísérletekben jellemeztük a PGC-1α jelenlétét a PDK4 (PARP-1 függő promóter) és az UCP3 (PARP-1 független promóter) promóterein.

C57/Bl6J hím egereket PJ34-gyel (10 mg/kg BID 5 napig), vagy fiziológiás sóoldattal kezeltünk, majd a m. gastrocnemiusban megvizsgáltuk, hogy a PARP gátlás hatását. A PJ34 kezelés hatékonyan gátolta a m. gastrocnemiusban a PARP aktivitást (10A ábra), ami a NAD⁺ szint és a SIRT1 aktivitás növekedésével járt együtt (10B ábra), ugyanúgy, mint PARP-1 deléciója, vagy a C2C12 sejtek PJ34-gyel történő kezelése esetében. A SIRT1 fehérje mennyisége nem növekedett (10A ábra). A PJ34 kezelt állatokban a szérum triglicerid (1.21 ±

0.08 mM vehikulum vs. 1.11 ± 0.04 mM PJ34; p = 0.08) és szabad zsírsav (1.59 ± 0.06 mEq/l vehikulum vs. 1.44 ± 0.03 mEq/l PJ34; p = 0.03) szintje lecsökkent. Ezek a változások együtt jártak a m. gastrocnemius expressziós mintázatának a változásával. A mioglobin, az UCP2, az UCP3 és az ndufa2 expressziójának szignifikáns emelkedését tapasztaltuk, míg a PGC1α és az Ndufa5 expresszió változása hasonló trendet mutatott (10C ábra), ami az izmokban a PJ34 kezelés hatására megnövekvő mitokondriális biogenezisre utal.

Vehicle 10 mg / kg PJ34 BID

A B C

10. ábra A PJ34 kezelés a mitokondriális biogenezis megemelkedéséhez vezet C57/Bl6J egerek harántcsíkolt izmaiban.

C57/Bl6J egereket öt napon át i.p. 10 mg/kg PJ34–gyel oldottuk kétszer naponta, majd a m.

gastrocnemiusból meghatároztuk (A) a PARP-1 autoPARilációját, a SIRT1 expresszióját, (B) az izom NAD⁺ koncentrációját, a SIRT1 aktivitást, illetve (C) több, a mitokondriális aktivitáshoz szükséges gén expresszióját.

Felvetődik, hogy létezik-e olyan metabolikus hatás, ami befolyásolja a PARP aktivációt.

Vizsgáltuk a PARP aktivitás változását a tápláltság függvényében. Meghatároztuk a PARP aktivitást C57/Bl6J egerek m. gastrocnemiusában 24 órás éhezés, illetve 12 hetes HFD diéta (hiperkalorikus, 60% zsírtartalom) után. Az éhezés hatására a PARP aktivitás lecsökkent, míg a kalorikus terhelés hatására a PARP aktivitás és a PARP-1 szintje megnő (11. ábra), vagyis úgy tűnik a PARP-1 valamilyen módon képes reagálni a tápanyag ellátottságra is.

etetett éheztetett chow HFD

11. ábra. A PARP aktivitás és expresszió változik a tápláltság függvényében

C57/Bl6J egerek m. gastrocnemiusában 24 órás éhezést, vagy 3 hónap HFD-t követően Western blottal meghatároztuk a PARP-1 fehérje expressziót és a PARP aktivitást a PARP-1 autoPARilációján keresztül.

Felvetődött, hogy más sirtuinok, a citoplazmatikus SIRT2 és a mitokondriális SIRT3 aktivitása megváltozik-e a PARP-1 deléciója hatására. Jellegzetes szubsztrátjaik (SIRT2 – tubulin, SIRT3 – Ndufa9) acetiláltsága azonban nem mutatott eltérést a két genotípus között egyik modell esetében sem (12A-C ábra). Ez arra utal, hogy a SIRT2 és a SIRT3 aktivitását nem befolyásolja a PARP-1 hiánya. Hasonlóképpen felvetődött, hogy a SIRT1 aktivitás megváltozása befolyásolhatja az AMPK aktivitását. Bizonyos kísérleti körülmények között (PARP-1^+/+ vs.

PARP-1^-/- MEF sejtek, MEF-ek, C2C12 sejtek PJ34 kezelése – 12D-E ábra) a pACC jel csökkent a PARP gátlás hatására, míg a Bl6 egerek PJ34 kezelése során nem volt nyilvánvaló változás a pACC szintben (12F ábra).

12. ábra A PARP-1 deléciója, vagy gátlása nem befolyásolja a SIRT2 és SIRT3, azonban gátolja az AMPK aktivitást.

(A-B) A tubulin és az Ndufa9 acetilációját Western blot technikával határoztuk meg (A) PARP-1^+/+ és PARP-1^-/- egerek m. gastrocnemiusában, illetve (B-C) PARP-1 csendesített HEK293T sejtekben. (D-F) A pACC szintet Western blot technikával határoztuk meg (D) MEF sejtekben, (E) C2C12 sejtekben és C57/Bl6J egerek m. gastrocnemiusában.

Végül megvizsgáltuk, hogy a májban okoz-e metabolikus eltérést a PARP-1 deléciója.

PARP-1^+/+ és PARP-1^-/- egerek több metabolikus gén expresszióját hasonlítottuk össze, de nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a két genotípus között (13A. ábra). Úgy tűnik, hogy a PARP-1-nek elhanyagolható metabolikus hatása van a májban, ami valószínűleg arra vezethető vissza, hogy expressziója nagyon alacsony ebben a szervben (13B. ábra).

13. ábra A PARP-1 deléciója nem okoz metabolikus változást a májban.

(A) PARP-1^+/+ és PARP-1^-/- egerek (n=8/9) májában megvizsgáltuk több metabolikus fehérjét kódoló gén expresszióját. (B) C57/Bl6J egerek (n=3) szerveiben összehasonlítottuk a PARP-1 expresszióját RT-qPCR technikával.