A PARP-1 és PARP-2 metabolikus szerepének molekuláris mechanizmusa

Munkám során a PARP-1 és PARP-2 enzimek metabolikus szerepét vizsgáltuk. A PARP-1 hiánya előnyös metabolikus fenotípust hoz létre, amit a harántcsíkolt izomban és a BAT-ban megnövekvő energialeadás jellemez. Eredményeink arra utalnak, hogy PARP-1 hiányában a SIRT1 aktivitása megemelkedik. A SIRT1 több fontos transzkripciós faktor deacetilálásával átrendezi a génexpressziót és több mitokondriális gén, mint a mitokondriális oxidáció vagy a zsírsav oxidáció génjei, expresszióját indukálja (Feige és mtsai, 2008, Lagouge és mtsai, 2006).

Ezért a SIRT1 diszfunkciója károsítja a mitokondrium működését, amiben központi szerepe van a mitokondriális fehérjék csökkent expressziójának is. A folyamat során a mitokondriális fehérjék sejten belüli aránya lecsökken és több stressz útvonal indukálódik, többek között a mitokondriumból kiinduló, fel nem tekeredett, vagy rosszul feltekeredett fehérjékre adott stresszválasz (mitochondrial unfolded protein response) (Houtkooper és mtsai, 2013, Mouchiroud és mtsai, 2013).

Értekezésemben bemutatott egér és sejtes modellekben a PARP-1 deléciója, vagy PARP gátlószer adása esetében a NAD⁺ szint emelkedését tapasztaltuk. Erre a legelfogadhatóbb magyarázatnak az tűnik, hogy a PARP-1 aktivitás (még stimulálatlan állapotban is!) jelentős mértékben használja a sejtek NAD⁺ készletét ezért a PARP-1 gátlása jelentős NAD⁺ megtakarítással jár. A PARP-1 affinitása a NAD⁺ iránt magas (Km = 20-60 µM (Ame és mtsai, 1999)), ami majd egy nagyságrenddel alacsonyabb a sejtek nyugalmi NAD⁺ szintjénél (200-500 µM) (Houtkooper és mtsai, 2010). Ez arra utal, hogy a NAD⁺ szint fiziológiás fluktuációja, sőt a PARP-1 aktiváció által előidézett NAD⁺ szint csökkenés sem képes jelentős mértékben csökkenteni a PARP-1 aktivitását. Könnyen elképzelhető tehát, hogy a PARP-1 aktivitás kiesése jelentős mértékben csökkenti a NAD⁺ lebontását, ami a NAD⁺ szint emelkedéséhez vezet. A PARP-1 felelős a sejtek, szövetek össz-PARP aktivitásának 85-90%-ért (Schreiber és mtsai, 2002), amit MOVAS és C2C12 sejtekben végzett kísérleteink igazoltak is, így érthető, hogy a PARP gátlószerek alkalmazása a PARP-1 delécióra jellemző fenotípust hoz létre.

A megemelkedő NAD⁺ szint aktiválja a SIRT1-et, mivel a SIRT1 érzékeny a NAD⁺ szint változásaira, Km értéke (150-200 µM) közel áll a nyugalmi NAD⁺ szinthez, azaz a NAD⁺ szint fluktuációja befolyásolhatja a SIRT1 aktivitását is. Ez arra is utal, hogy a PARP-1 és a SIRT1 között a molekuláris kapocs a NAD⁺ szint változása. A nagyobb affinitású és hatékonyabb

limitálásával, hanem a PARP-1 deacetilálásával éri el gátló hatását (Pillai és mtsai, 2005, Rajamohan és mtsai, 2009). Belátható, hogy a SIRT1 és a PARP-1 kölcsönösen szabályozza egymás működését (31. ábra). Fontos kiemelni, hogy a fiziológiás/patofiziológiás hatások, amelyeket a PARP-1 aktivációhoz köthetőek javarészt átfednek a SIRT1 gátlásához, vagy hiányához köthető fiziológiás/patofiziológiás folyamatokkal, ami arra utal, hogy a két enzim aktivitása közti „egyensúly” megbomlása több betegség kialakulásában is szerepet játszhat.

PARP aktiváció

- Véd az oxidatív károsodás ellen.

- Gyulladáscsökkentõ.

31. ábra. A PARP-1 és a SIRT1 közötti kapcsolat

A PARP-2 a PARP-1-hez hasonlóan NAD⁺-függő enzim, így joggal vetődött fel, hogy azonos mechanizmus szerint a PARP-2 deléciója a NAD⁺ szinteket képes növelni és ezen keresztül aktiválja a SIRT1-et. A PARP-2^-/- egerek szöveteiben és sejtes modellekben a NAD⁺ szintet meghatározva azonban diverz képet kaptunk. Ellentétben a PARP-1 aktivitás modulálásával nem minden modellben emelkedett a NAD⁺ szint a PARP-2 deléciója esetében, ami a NAD⁺ szint változásától eltérő mechanizmusra utalt. A PARP-2 kinetikai jellemzői hasonlítanak a SIRT1-re: NAD⁺-ra vonatkoztatott KmPARP-1 > KmPARP-2 ~ KmSIRT1 (Ame és mtsai, 1999, Houtkooper és mtsai, 2010), ezért valószínűtlen, hogy PARP-2 aktiváció megfelelő mértékben csökkenti a NAD⁺ szubsztrátot a SIRT1 elől, ezért feltehető, hogy a PARP-1 deléció hatásától eltérő molekuláris mechanizmussal állunk szemben.

Minden alkalmazott modellben a PARP-2 deléciója esetén a SIRT1 expresszió növekedését tapasztaltuk és kimutattuk, hogy a PARP-2 a SIRT1 promóter represszora. Hiányában a

promóter aktiválódik és a SIRT1 fehérje mennyiségének növekedése vezet a SIRT1 aktivitás indukciójához. A SIRT1 promóterét szabályzó transzkripciós faktorok közül többet ismerünk, mint azt a Bevezetőben tárgyaltuk. A tápanyag ellátottságot integrálják a PPAR-ok (Han és mtsai, 2010), a CREB, a ChREBP (Noriega és mtsai, 2011), a p53 és a FOXO-k (Nemoto és mtsai, 2004), míg a redox környezet jeleit a cMyc (Yuan és mtsai, 2009) és a HIC1 (hypermethylated in cancer-1 (Chen és mtsai, 2005, Zhang és mtsai, 2007)) (32. ábra). A PARP-2 jelenlétét és transzkripciós aktivitását moduláló hatások egyelőre nem ismertek.

Feltételezhető, hogy hasonlóan a Myc-hez és a HIC1-hez, a környezet redox állapotát közvetíti.

A SIRT1 expressziója, illetve a egyes SNP-k a SIRT1 génben összefüggést mutatnak az energialeadás, az inzulin szenzitivitás (Rutanen és mtsai, 2010), az inzulin szekréció (Dong és mtsai, 2011) és az elhízásra való hajlam mértékével emberben (Clark és mtsai, 2012, Zillikens és mtsai, 2009, Zillikens és mtsai, 2009), vagyis a SIRT1 promóterének aktivitása úgy tűnik fontos faktora a metabolikus adaptációnak, amiben a promótert szabályzó transzkripciós faktoroknak központi szerepe lehet.

32. ábra. A SIRT1 promóter szerkezete a transzkripciós faktorok kötődési helyének megjelenítésével

A számok a humán SIRT1 promóter nukleotid sorrendjének megfelelő helyeket jelzik. Azokat a transzkripciós faktorokat, amelyek kapcsolódási helye nem ismert úgy ábrázoltam, hogy ne kapcsolódjon a DNS szálhoz. Az ismert működő konszenzus szekvenciákat világos téglalapok jelölik a DNS szálban.

A PARP-2 más metabolikus transzkripciós faktorok működésébe is beavatkozik, a fehér

magreceptorral képes kölcsönhatásba lépni (pl. az ERβ receptor aktivitását nem befolyásolja a PARP-2 expresszió változása, míg a PPAR-ok, vagy az ERα aktivitását igen), várhatóan más magreceptorok működésébe is beleszólhat a PARP-2, ennek megismerése, azonban további vizsgálatokat igényel.

A PARP-1 több magreceptorral is kölcsönhat, amit a Bevezetés 1. táblázatában összesítettünk. A PARP-1-en belül több magreceptorokkal kölcsönható régiót is leírtak, mint a második cink ujj motívumot (Miyamoto és mtsai, 1999, Pavri és mtsai, 2005) és a BRCT domént (Pavri és mtsai, 2005). A PARP-2 fehérjében található egy nagymértékben konzervált magreceptor aktivációs motívum (LIQLL szekvencia az E doménben). Feltételezhető, hogy a PARP-2 – magreceptor kölcsönhatás során ennek a motívumnak a jelenléte elsődleges fontosságú.

Milyen molekuláris mechanizmuson keresztül aktiválja az RXR-PPARγ dimert a PARP-2? A kromatin immunprecipitációs kísérletek arra utalnak, hogy a PARP-2 transzkripciós események során a DNS-hez kötődik. A PARP-2 több abnormális DNS szerkezethez is kötődhet (Kutuzov és mtsai, 2013), amelyek közül több megjelenik a transzkripció során, mint a DNS kétszálú törése (Ju és mtsai, 2006). Az ER aktivációja során a topoizomeráz II működése kettős szálú DNS töréseket hoz létre a topológiai stressz feloldása során (Ju és mtsai, 2006), amelyek javítása szükséges a hatékony transzkripcióhoz. A kettős törések javításának megindításában központi szerepe van a PARP-1 által katalizált PARilációnak (Ju és mtsai, 2006, Le May és mtsai, 2012). Mivel a PARP-1 és a PARP-2 is szerepet játszik a kettőszálú DNS törések javításában (Huber és mtsai, 2004, Langelier és mtsai, 2012, Schreiber és mtsai, 2002, Yelamos és mtsai, 2008) feltételezhető, hogy a PARP-1-hez hasonló mechanizmussal vesz részt a PARP-2 magreceptorok működésének regulációjában. Ezen felül a PARP-2 a transzkripciós események beindításához valószínűleg az epigenetikai faktorok megváltoztatásán keresztül is hozzájárul. Erre utal, hogy a hiszton PARiláció megváltozik a magreceptor aktiváció során, ami befolyásolja a környezetének hiszton metilációs mintázatát is (Fujiki és mtsai, 2013, Quenet és mtsai, 2009).

A PARP-2 által közvetített represszió molekuláris mechanizmusa valamivel jobban tisztázott, mint az aktiváció mechanizmusa. Quenet és munkatársai (Quenet és mtsai, 2008)

kimutatták, hogy a PARP-2 a kormatin szerkezet zártabbá válását, a heterokromatin megjelenését segíti elő. Liang és munkatársai (Liang és mtsai, 2013) kimutatták, hogy a PARP-2 az általa represszált promótereken az HDAC5 és HDAC7 hiszton-deacetilázok, illetve a G9a hiszton metiltranszferáz akkumulációjához vezet és a represszált kromatinra jellemző acetilációs és metilációs mintázatot hoz létre. Ugyanez a munkacsoport (Liang és mtsai, 2013) kimutatta továbbá, hogy ezen hiszton módosító enzimek akkumulációja független a PARP-2 enzimatikus aktivitásától. Hozzá kell tennem, hogy a PARP-2 hiányában nagyfokú génexpressziós átrendeződést írtak le Farres és munkatársai (Farres és mtsai, 2013). Saját, közlés alatt lévő, microarray kísérleteinkben a PARP-2 depléciója után több, mint 600 gén expressziójának változását tapasztaltuk. Közülük ~450 gén expressziója csökkent, míg ~150 gén expressziója nőtt. Ismert, hogy a PARP-1 nagyon sokrétűen avatkozik be a transzkripciós folyamatokba (Kim és mtsai, 2004, Kraus, 2008, Kraus és Hottiger, 2013, Krishnakumar és mtsai, 2008) és a PARP-2-vel fennálló szerkezeti és funkcionális analógia, illetve az, hogy a PARP-2 deléciója széleskörű génexpressziós változásokat okoz arra utal, hogy a PARP-2-ről a PARP-1-hez hasonló, szerteágazó transzkripciós tulajdonságokat fognak leírni a jövőben.