Egyéb biokémiai és immunológiai módszerek 1. Limfocitaproliferáció

A patkánylép perfúziójával nyert sejteket RPMI 1640 szövetkultúra-médiumban szuszpendáltuk, amely 10 % hőinaktivált fötális borjúszérumot, 25 mM HEPES-puffert, 2 mM L-glutamint, 100 IU/ml penicillint, 100 µg/ml gentamycint, 7,5 µg/ml amphotericin–B-t tartalmazott. 200 µl térfogatban 4x10⁵ sejtet pipettáztuk „flat bottomed microplate“ lemezre. Négy paralallelt készítettünk. A sejtekhez 1, 5 és 10 µl/ml koncanavalin-A–t adtunk. A kontrollokhoz nem adtunk lektint. A lemezeket 37 ^oC-on 5 % CO2–ot tartalmazó nedves légtérben 72 órán keresztül inkubáltuk, és 48 órás inkubálás után 4 µl ³H-thimidinnel kezeltük. A sejteket szeparáló automatával filterpapíron összegyűjtöttük és az izotóp meghatározást liquid-scintillaciós számlálóban (Nuclear Chicago Isocap 300, (USA) végeztük. Az eredményeket cpm-ben adtuk meg (Gonzalez-Cabello, R., 1987).

3.8.2. Lépsejtpreparálás

A patkányok lépsejtjeit Müzes és munkatársai szerint (1989) izoláltuk. A makrofágokat 24 lyukú adherens plasztik lemezen 10x10⁶ sejt/ml koncentrációban 2 órán át 37 ^oC–on 5 % CO2 –ot tartalmazó nedves légtérben kitapasztottuk. A nem kitapadt sejteket erőteljes mosással

(szövetkultúra-médium) távolítottuk el. A kitapadt sejteket összegyűjtöttük, kétszer mostuk, majd reszuszpendáltuk RPMI 1640 médiumban, és a sejtszámot 1,5x10⁶ sejt/ml-re állítottuk be.

3.8.3.

Az izolált lépsejteket 20 µg/ml E. coli 0111:B4 LPS-dal (lipopoliszacharid) inkubáltuk. 24 óra után a sejtmentes felülúszót centrifugálás után összegyűjtöttük és steril szűrőn átszűrtük (0,22 µm Millipore, USA). A mintákat a meghatározásig –20 ^oC-on tároltuk.

3.8.4. IL-1-aktivitás meghatározás

Az IL-1 meghatározáshoz az előzőekben leírtak szerint készült szupernatánst használtuk és a méréshez 5-7 hetes C3H/HeJ egerek timocitáit használtuk fel. Az egyszerű sejtszeparálás után a sejtszámot 1,5x10⁶sejt/cső-re állítottuk be és 48 órán át 37 ^oC-on nedves légtérben 1.0 µg/ml Con-A–val inkubáltuk a vizsgálandó szupernatánssal együtt. Az inkubálás végeztével 18 órán át 0,4 µCi/cső ³H-timidinnel folytattuk tovább az inkubálást megfelelő kontrollminták mellett. A sejteket végezetül filteren összegyűjtöttük és a timidinbeépülést liquid-scintillációs számlálóban Nuclear Chicago Isocap 300 (USA) határoztuk meg. Az eredményeket cpm-ben adtuk meg.

3.8.5. TNF-α-citotoxicitás meghatározása

TNF-α-citotoxicitás meghatározását HEp-2 célsejteken Müzes és munkatársai módszere (1989a) szerint végeztük. Cincinnati HEp-2 adherens humán epipharynx carcinoma célsejteket tenyésztettünk 10 % hőinaktivált fötális borjúszérum, 25 mmol/l HEPES, 2 mmol/l L-glutamin és antibiotikum kiegészítésű Eagle’s MEM-ben. Az elpusztult sejtek felülúszóval történő eltávolítása után a HEp-2 sejteket 0,5 ml 0,1 % tripszint tartalmazó TC 199 médiumban reszuszpendáltuk és kétszer mostuk. A reszuszpendált HEp-2 célsejteket (2,5x10³sejt/cső) 96-lyukú “flat bottom microtiter plate”-re vittük és 4 µCi/cső triciált timidinnel kezeltük. A tesztelni kívánt szupernatánst hozzáadtuk a sejtekhez, és 24 órán át 37 ^oC-on inkubáltuk 5 % CO2–ot tartalmazó nedves légtérben megfelelő kontroll mellett. A beépült radioaktivitást az előzőekben leírtak szerint határoztuk meg. Hat párhuzamos mérést végeztünk. A citotoxicitást %-ban adtuk meg.

3.8.6. Citokinek meghatározása kitekkel 3.8.6.1. IL-1β -meghatározás

Az IL-1β kit, szilárdfázisú, enzimmel jelzett immundiagnosztikai készítmény. A mikrotitráló lemez mélyületeinek felületén kötött monoklonális humán IL-1β-ellenanyagok reagálnak a szérum- vagy plazmamintákban levő IL-1β molekulákkal. Az így képződött immunkomplex reagál a következő lépésben bemért anti-humán-IL-1β tormaperoxidázzal jelzett monoklonális

ellenanyaggal. Az enzimre specifikus TMB-szubsztrát-oldattal kapott színreakciót 450 nm-en mérjük.

3.8.6.2. IL-6-meghatározás

A meghatározás lényege: szilárdfázisú, enzimmel jelzett immundiagnosztikai módszer. A kötött poliklonális humán IL-6-ellenanyagok reagálnak a szérum- vagy plazmaminták IL-6 molekuláival. A keletkezett immunkomplex a következő lépésben anti-humán-IL-6 tormaperoxidázzal jelzett monoklonális ellenanyaggal reagál. Az enzimre specifikus TMB szubsztráttal kapott színreakció 450 nm-en mérhető.

3.8.6.3. TNF-α-meghatározás

A Biosource TNF-α kit szilárdfázisú szendvics–módszeren alapul. Humán monoklonális–TNF-α-ellenanyaggal fedett lemez köti a szérum TNF-α-t. A szinreakció kialakulásához biotinilált monoklonális hTNF-α-antitestet alkalmazunk és streptavidin-peroxidázt. A leolvasás 450 nm-en történik.

3.8.7. Tumormarkerek meghatározása kitekkel

A tumormarkereket LIA-mat lumineszcens immunkémiai módszerekkel határoztuk meg.

3.8.7.1. AFP-meghatározás

A vizsgálatot, a kit leírása szerint végeztük. A módszer lényege: a szérumot monoklonális AFP-antitesttel fedett csőben megkötjük, majd anti-AFP-tracer-konjugátumot adunk hozzá. A detektáláshoz luminolos reagents használunk. Referenciatartomány: 6 ng/ml alatt.

3.8.7.2. CEA-meghatározás

A vizsgálatot, a kit leírása szerint végeztük. A módszer lényege: a szérumot CEA monoklonális antitesttel fedett csőben megkötjük, majd anti-CEA-tracer-konjugátummal reagáltatjuk. A detektáláshoz luminolos reagents használunk. Referenciatartomány: 0-4 ng/ml.

3.8.7.3. CA-19-9-meghatározás

A vizsgálatot, a kit leírása szerint végeztük. A módszer lényege: a szérumot CA-19-9-antitesttel fedett csőben megkötjük, majd anti-CA-19-9-tracer-konjugátummal reagáltatjuk. A detektáláshoz luminolos reagents használunk. Referenciatartomány: 37 U/ml alatt.

3.8.8. Glutation-peroxidáz meghatározása kittel

A meghatározás a RANSEL RS505 kit leírásában ajánlott módszer szerint történt. A módszer lényege: a glutation-peroxidáz a glutationt oxidálja kumén-hidroperoxid jelenlétében. A glutation-reduktáz és a NADPH az oxidált glutationt visszaalakítja redukált formába, és a NADP⁺ 340 nm-en mérhető.

3.8.9. Szuperoxid-dizmutáz meghatározása kittel

A meghatározás a RANSOD SD125 kit leírásában ajánlott módszer szerint történt. A módszer lényege: a SOD a xantin - xantinoxidáz rendszerben keletkező szuperoxidaniont oxigénre és hidrogén-peroxidra bontja. A szuperoxid a 2-(4-jodofenil)-3-(4-nitrofenol)-5-fenil-tetrazolium-klorid)-dal reagál és vörös színű formazán keletkezik. A SOD gátolja a színképződést. A leolvasás 505 nm-en történik.

3.8.10. Epesavak meghatározása enzimatikus kolorimetriás kittel

A DI-45311 epesavkittel történő meghatározás lényege: NAD és 3-α-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz jelenlétében a szérum 3-α-hidroxi-epesavak specifikusan 3-keto-származékká alakulnak át, miközben NADH keletkezik. A NADH diafozáz által katalizált reakcióban tetrazóliumsóból formazánt képez. A szinreakció 540 nm-en detektálható.

3.8.11. Vörösvértest-hemolizátum hemoglobintartalmának meghatározása

A vörösvértest-hemolizátumok hemoglobintartalmát ciánhemoglobin formában Hemisol standard és Hemisol-reagens segítségével határoztuk meg (Human Oltóanyagtermelő és Gyógyszergyártó Rt. Gödöllő). A vörösvértest-hemolizátumok hemoglobintartalmát 10 mg/ml-re állítottuk be fiziológiás sóoldattal.

3.8.12. Biológiai minták fehérjetartalmának meghatározása

A fehérjetartalmat Lowry és mtsai (1951) módszerével határoztuk meg fotometriásan 650 nm-en, standardként bovin szérumalbumint alkalmaztunk Az eredményeket mg/ml-ben adtuk meg.