DNS izolálás lépései

A DNS izolálások során a rendelkezésemre álló mintamennyiségtıl függıen a Wizard technika (Zimmermann et al. 1998) segítségével 2 vagy 3 párhuzamos izolálás történt. A darált és homogenizált mintákat 2 ml-es centrifuga-csövekbe mértem, mintánként 300 mg-ot. Ehhez 860 µl Wizard puffert, 100 µl guanidin-hidroklorid oldatot és 40 µl proteináz-K-t adtam. Az így kapott minta oldatot 3 óráig rázatva inkubáltam 60°C-on, majd 10 percig centrifugáltam (12400 rpm, AB2.14 szögrotor). Ezek után steril Eppendorf csövekben 500 µl felülúszót 1 ml Wizard gyantához adtam, amelyet összerázás után fecskendıvel egy speciális Wizard mini szőrıoszlopon átnyomtam.

A DNS-t tartalmazó gyanta az oszlopban lévı szőrın fennmaradt. A gyantát tartalmazó oszlopon ezután 2 ml, 80%-os izopropanol oldatot nyomtam át fecskendı segítségével, a gyanta gömböcskéken maradt szennyezıdések eltávolítására. A fennmaradt alkoholt centrifugálással

AB2.14 szögrotor). Az izolált DNS oldatok tisztasági fokát és a DNS koncentrációkat spektrofotometriás méréssel határoztam meg, majd felhasználásig -20°C-on tároltam ıket.

4.4.2. A tisztított DNS oldatok jellemzése

A DNS oldat jellemzésére spektrofotometriás mérést végeztem, a hıkezelt minták DNS töredezettségét pedig az optimálás során agaróz gélelektroforézissel ellenıriztem.

A technológiai feldolgozás DNS-re gyakorolt hatását, a fragmentumnagyság változását 2 %-os agaróz gélelektroforézissel ellenıriztem. Az elektroforézist Maniatis et al. (1989) szerint végeztem 120x80x5 mm géllapon, 100 V állandó feszültség mellett, 45 percig, 12 µl DNS oldat/zseb mintafelvitellel, 1xTBE pufferben. A géleket SYBER Green I. gélfesték (Sigma) oldattal (0,1 µl/ml) festettem, majd UV fény alatt lefényképeztem és kiértékeltem.

4.4.3. DNS sokszorozás

A primer párokat az irodalomban ismertetett szekvencia információk alapján szintetizáltattam.

A kiválasztás során figyelembe vettem, hogy a hıkezelés egyes esetekben akár 1000 bp alá is csökkentheti az átlagos DNS méretet. A szekvenciákat és a vonatkozó referenciákat a 10.

táblázatban soroltam fel.

10. táblázat A különbözı polimeráz láncreakciók során alkalmazott primerpár szekvenciák összefoglalása

Primer

jelölése Primer szekvenciája Referencia Célgén

B49317 5’-CGAAATCGGTAGACGCTACG -3’

A kinyert DNS tisztaságát, illetve sokszorozhatóságát B49317 és A49855 kloroplasztisz DNS primer pár segítségével vizsgáltam. A DNS eredetét a búza specifikus TR01/TR02 primer párral igazoltam, amelyet Allmann és munkatársai (1993) terveztek.

Továbbá a P1/P2 primer párt alkalmasnak találtam glutenin kontamináció detektálására, mivel Törjék és munkatársai kísérleteik során nem tudtak jellemzı markereket és fajtákon belüli polimorfizmust detektálni ezzel a primer párral, illetve ez a primer pár a glutén egyik összetevıjét, a glutenint kódoló gén egy nem kódoló szakaszát sokszorozza.

Végül egy másik speciális kloroplasztisz DNS primer párt (WBR11/WBR13) alkalmaztam cöliákiás tüneteket okozó gabonafajokkal való szennyezıdés kiszőrésére.

A PCR vizsgálat elıtt a különbözı koncentrációjú DNS oldatokat 25 ng/5 µl töménységőre hígítottam. A DNS sokszorozást 25 µl és 50 µl végtérfogatban, vékony falú PCR csövekben végeztem el. A végtérfogat az alkalmazott PCR készülékek függvénye volt. A készülékválasztás tapasztalati úton történt és nagyban befolyásolta a készülékek hőtési és főtési sebessége, amely a különbözı primer párok mőködése szempontjából fontos befolyásoló tényezınek bizonyult.

Negatív kontrollként DNS-t nem tartalmazó vak próbát alkalmaztam. Az élelmiszervizsgálatok esetében pozitív kontrollként az adott vizsgálatnak megfelelı gabonafélébıl izolált DNS oldatot használtam. A reakciót minden esetben forró indítással (94°C) kezdtem, ezzel csökkenthetı volt a nem specifikus termékek képzıdése. A láncreakciót minden esetben hőtéssel állítottam le (4°C). A hıkezelt mintáknál a reakció érzékenységének növelése érdekében bizonyos esetekben szükség volt a templát DNS mennyiség 25 ng/5 µl-rıl 250 ng/5 µl-re növelésére, illetve a ciklusszám módosítására. A további ciklusparaméterek adatait a követekezıkben foglaltam össze.

Növényspecifikus primerre (B49317/A49855) kidolgozott PCR szakaszai

A PCR elegyet mintánként 0,5 ml-es vékony falú PCR csövekbe állítottam össze:

0,5-0,5 µl oligonukleotid (primer) oldat (reakció elegyben a primer végkoncentrációja: 0,1 µM volt)

6,5 µl bidesztillált víz 12,5 µl master mix

5 µl izolált DNS (25 ng/5 µl)

Az PCR elegy végsı mennyisége 25 µl volt. Az amplifikálásra alkalmazott készülék a Perkin ELMER GeneAmp PCR System 2400 volt.

Alkalmazott program:

Ciklus szám: 35

Elıdenaturáció: 94°C-on, 2 percig Denaturáció: 96°C-on, 20 másodpercig

Primer kapcsolódás (annealing): 59°C-on, 40 másodpercig

Komplementer szál szintézise (extenzió): 72°C-on, 40 másodpercig Végsı lánchosszabbítás: 72°C-on, 3 percig

Búza specifikus primerre (TR01/TR02) kidolgozott PCR szakaszai

A PCR elegyet mintánként 1 ml-es vékony falú PCR csövekbe állítottam össze:

4-4 µl oligonukleotid (primer) oldat (reakció elegyben a primer végkoncentrációja: 0,4 µM volt)

12 µl bidesztillált víz 25 µl master mix

5 µl izolált DNS (25 ng/5 µl)

Az PCR elegy végsı mennyisége 50 µl volt. Ebben az esetben az amplifikálásra a BLS PDR-91 DNA Reproducer készüléket alkalmaztam.

Alkalmazott program:

Ciklus szám: 30

Elıdenaturáció: 94°C-on, 2 percig Denaturáció: 95°C-on, 20 másodpercig

Primer kapcsolódás (annealing): 65°C-on, 30 másodpercig

Komplementer szál szintézise (extenzió): 72°C-on, 10 másodpercig Végsı lánchosszabbítás: 72°C-on, 2 percig

Glutén specifikus primerre (P1/P2) kidolgozott PCR szakaszai

A PCR elegyet mintánként 0,5 ml-es vékony falú PCR csövekbe állítottam össze:

0,5-0,5 µl oligonukleotid (primer) oldat (reakció elegyben a primer végkoncentrációja: 0,1 µM volt)

6,5 µl bidesztillált víz 12,5 µl master mix

5 µl izolált DNS (25 ng/5 µl)

Az PCR elegy végsı mennyisége 25 µl volt. Az amplifikálásra alkalmazott készülék a Perkin ELMER GeneAmp PCR System 2400 volt.

Alkalmazott program:

Ciklus szám: 40

Elıdenaturáció: 94°C-on, 2 percig Denaturáció: 94°C-on, 10 másodpercig

Primer kapcsolódás (annealing): 60°C-on, 30 másodpercig Komplementer szál szintézise (extenzió): 72°C-on, 1 percig Végsı lánchosszabbítás: 72°C-on, 2 percig

Búza-, árpa- és rozs-specifikus kloroplasztisz primerre (WBR11/WBR13) kidolgozott PCR szakaszai

A PCR elegyet mintánként vékony falú 0,5 ml-es PCR csövekbe állítottam össze:

2,5-2,5 µl oligonukleotid (primer) oldat (reakció elegyben a primer végkoncentrációja: 0,5 µM volt)

2,5 µl bidesztillált víz 12,5 µl master mix

5 µl izolált DNS (25 ng/5 µl)

Az PCR elegy végsı mennyisége 25 µl volt.

Jelen esetben is a Perkin ELMER GeneAmp PCR System 2400-as készüléket alkalmaztam a sokszorozásra.

Alkalmazott program:

Ciklus szám: 35

Elıdenaturáció: 94°C-on, 3 percig Denaturáció: 96°C-on, 20 másodpercig

Primer kapcsolódás (annealing): 60°C-on, 1 perc 20 másodpercig

Komplementer szál szintézise (extenzió): 72°C-on, 1 perc 20 másodpercig Végsı lánchosszabbítás: 72°C-on, 3 percig