Disszociáció – protonálódási egyensúlyok

A flavonoidok disszociációs, illetve protonálódási folyamatainak kvantitatív ismerete nélkülözhetetlen a faextraktanyagok és a fémionok közötti kölcsönhatás magyarázatához, elsősorban a komplexkémiai egyensúlyok értelmezéséhez.

A kvercetin, robinetin és rutin molekulákban kialakuló intramolekuláris hidrogénkötések stabilizálhatják a hidrogének helyzetét, ami gátolja a hidrogén-ionok disszociációját az OH-csoportokról. Ezért rájuk is jellemző (mint a flavon-származékokra általánosan), hogy gyen-gén savas karakterűek – csak a 7-OH-csoport disszociábilis kis mértékben.

Annak ellenére, hogy a flavon-származékok kémiai egyensúlyait évtizedek óta számos kutatócsoport vizsgálja (DETTY, HESTON és WENDER 1955; DELAPORTE és MACHEIX 1972;

BELIKOV és TOCHKOVA 1973; MAKASHEVA és GOLOVKINA 1973; KENNEDY és mtsai 1984;

MALEŠEV ésRADOVIĆ 1987), a flavonoidok disszociációs egyensúlyára vonatkozó kvantitatív eredmények még ma is csak nehezen felderíthetők. A hivatalosan elfogadott „IUPAC Stability Constants Database” (80000 adattal) a kvercetin, a rutin vagy a robinetin disszo-ciációs állandójára vonatkozó információt nem tartalmaz. Ennek oka lehet az is, hogy a kver-cetin és a robinetin ilyen jellegű vizsgálata nagyon körülményes (MOLNÁRNÉ 2002b).

A monohidroxi-flavonok disszociációs készségét, illetve protonálódási állandóikat összehasonlítva megállapíthatjuk, hogy a potenciometrikus titrálással (THOMPSON, WILLIAMS

és ELLIOT 1976), az UV-VISspektrofotometriás és fluoreszcenciás vizsgálatokkal (WOLFBEIS

8. táblázat Monohidroxi-flavonok protonálódási állandói (pKa) különböző irodalmi adatok alapján

flavonoid ^THOMPSON WOLFBEIS L^EMAŃSKA

3-hidroxi-flavon 3-OH 10,34 9,9

5-hidroxi-flavon 5-OH 11,44 11,5

7-hidroxi-flavon 7-OH 8,48 7,39 8,5

4’-hidroxi-flavon 4’-OH 8,28 7,9

3’-hidroxi-flavon 3’-OH 9,75 9,5

LEMAŃSKA és mtsai (2001) a 3-hidroxi-flavon és az 5-hidroxi-flavon kismértékű disszo-ciációját azzal magyarázza, hogy a molekulákban nagyon erős hidrogénhíd alakul ki az OH-csoport és a 4-karbonil között. Megfigyelték azt is, hogy ezen származékok abszorpciós spektruma a növekvő pH-val csak a növekvő anionkoncentrációt mutatja, vagyis csak disszo-ciációs folyamatok mennek végbe, és egyéb reakciók nem.

A kvercetin protonálódási állandójának irodalmi adatai igen szélsőséges határok között változnak (9. táblázat). Ez egyrészt nagyon különböző tulajdonságú oldószerek használatából, másrészt a meghatározás kivitelezésének bonyolultságából adódik.

9. táblázat A kvercetin és rutin disszociációs állandói (pKa) különböző irodalmi adatok alapján

A szakirodalomban egyáltalán nem tükröződik az a tapasztalat (MOLNÁRNÉ 1997-2002), hogy a kvercetin lúgos közegben bekövetkező igen gyors szerkezeti változása nem teszi lehetővé a potenciometrikus titrálás metodikájának használatát. Még a napjainkban közölt dolgozatok között is megtalálható a kvercetin disszociációs állandójának sav-bázis-titrálással történő meghatározása.

TYUKAVKINA és POGODAEVA (1975) a flavon-származékok spektrofotometriás vizsgálata során számos vegyület protonálódási állandóját meghatározta, amelyről közleménysorozatban számoltak be. A kvercetin esetében a molekula háromlépéses disszociációját tudták érzékelni különböző arányú metanol:víz elegyekben.

THOMPSON, WILLIAMS és ELLIOT (1976) az egyes flavonoidok protonálódási állandóját potenciometrikus titrálással határozták meg 25 °C-on, 50 %-os (v/v) 1,4-dioxán:víz elegyben, 0,1 mol/dm³ NaClO4 ionerősség mellett. A kvercetin esetében csak egyetlen hidrogénion disszociációját érzékelték, amelyet az egyetlen OH-csoportot tartalmazó származékok vizsgá-latában kapott eredményük összehasonlítása alapján a 7-OH csoporthoz rendeltek.

A potenciometrikus meghatározási módszer miatt sajnos erős kritikával kell fogadni (az egyébként körültekintéssel végzett) munkájukat, mivel – saját tapasztalatom alapján (MOLNÁRNÉ 2002c) – a kvercetin átalakulási reakciói következtében a nem pufferolt oldat pH-ja nem stabil, és a sav-bázis-titrálást csak különleges feltételek betartása esetén lehet elvégezni. A többi irodalmi adattal összehasonlítva megfigyelhető, hogy meghatározási mód-szerük azokra a vegyületekre mutat egybevágó értéket (8. táblázat), amelyek az oldat kém-hatásának változása során valóban csak disszociációs egyensúlyi folyamatokban vesznek részt, további reakciók nem játszódnak le.

ESCANDAR és SALA (1991) potenciometrikus és spektrofotometriás módszert alkalmazott a kvercetin és rutin protonálódási állandójának meghatározására. Vizsgálatukat vizes közeg-ben, 20 °C-on, 0,1 mol/dm³ NaNO3 ionerősség beállítása mellett végezték. Közleményükben a flavonoid-molekulák valamennyi OH-csoportjának disszociációjára adnak meg adatot, azon-ban nem megfelelő vizsgálati eljárásuk miatt azokat erős fenntartással kell kezelni.

A szerzők a kvercetin és a rutin oldását ugyanis nátrium-hidroxid oldatban végezték, és a pH-értékeket utólagos salétromsav adagolással állították be. Ez a – más esetben elvében jó – megoldás a kvercetin esetében a disszociációt követő szerkezetváltozásokat (pl. szolvolízis, autooxidáció, bomlási folyamatok) nem tudja elkerülni, ami a bemutatott abszorpciós spektru-mokból egyértelműen megállapítható (25. ábra). Vagyis – az előbbi fejezetben ismertetett publikációk (DANGLES, FARGEIX és DUFOUR 1999; MAKRIS és ROSSITER 2000) alapján, vala-mint saját tapasztalatom szerint (MOLNÁR-HAMVAS és mtsai 2002) – a kvercetin fényelnyelé-séből vagy a titrálási görbéjéből számított állandók nem a disszociáció, hanem valamilyen

25. ábra A kvercetin abszorpciós spektruma különböző pH-jú vizes oldatban lúgos oldást követő kémhatás beállítás esetén (ESCANDAR és SALA 1991) alapján SAUERWALD és mtsai (1998) spektrofotometriás módszert alkalmaztak növényi poli-fenolok protonálódási állandójának meghatározására. A kvercetin kis mértékű oldódásából eredő nehézségeket etanol:víz = 21,4:78,6 térfogatarányú elegy használatával küszöbölték ki.

Méréseik során a pH = 7-10 tartományban tapasztalták a kvercetin fokozatos bomlását, ezért az átalakulás kinetikáját figyelembe véve, a t = 0 időpontra extrapolált abszorbanciákkal végezték a számításokat. Körültekintő munkájuk, adatokkal és ábrákkal alátámasztott érve-lésük, a mérési eredményeik megbízhatóságát bizonyítja. A kvercetinre két lépcsőben történő disszociációt tudtak elkülöníteni, és – az analóg vegyületek állandónak értéke alapján – első lépésben inkább a 4’-OH csoport deprotonálódását tartják valószínűnek.

LEMAŃSKA és mtsai (2001) elméleti számításokkal – a disszociációs energia és ionizációs potenciál számítógépes becslésével – határozták meg különböző flavonok relatív protonáló-dási állandóját. Számításaik összhangban vannak a különböző kísérleti módszerekkel kapott adatokkal, és megfigyelésekkel, hogy a 7-OH és a 4’-OH csoportokról disszociál leginkább a hidrogén-ion. Dolgozatukban összehasonlították az egyes polifenolok disszociációs készségét és a vizsgált vegyületek antioxidáns aktivitását, valamint tanulmányozták a pH hatását ezekre a folyamatokra.

KUNTIĆ és mtsai (2003) dolgozatukban a kvercetin disszociációs állandójának potencio-metrikus meghatározásának eredményeit ismertetik. A titrálást 50 tf% etanol tartalmú vizes oldatban végezték, különböző hőmérsékleten. A számított értékek jelentős mértékben eltérnek a többi irodalmi adattól, és irreálisan erős savként jellemzik a kvercetint.

A rutin protonálódási állandói a második disszociációs lépéstől kezdődően egy nagyság-renddel különböznek a két publikációban közölt irodalmi adatok alapján (9. táblázat).

ESCANDAR és SALA (1991) vizsgálati módszere a kvercetinnél használt metodikával megegyező. A rutin kisebb fokú lúgérzékenysége miatt ezek az eredmények talán elfogad-hatóak, bár a savas közegben felvett abszorpciós spektrum széles összetett sávokat mutat – nem egyezik meg a spektrumtár megfelelő görbéjével (3. melléklet) –, ami ebben az esetben is kétségeket támaszt.

JOVANOVIC és mtsai (1994) a protonálódási állandókra kapott spektrofotometriás mérési eredményeiket táblázatos formában adják meg, más publikációkból átvett adatokkal együtt, és a mérési körülményeket nem ismertetik. A közleményben fenoxi-származékok spektrális, sav-bázis és redoxi sajátságainak vizsgálati eredményeit mutatják be részletesen. A vizsgálatot vizes oldatok pulzáló radiolízis technikával, a közeg pH-jának függvényében végezték. A módszer gyökök képződését váltja ki, vagyis nem disszociáló H⁺-ion távozik a molekuláról, hanem H-atom. Így annak ellenére, hogy elnevezésében megegyezik a két folyamat, a kapott adat valójában nem a savi disszociáció mértékére ad felvilágosítást. A rutin „deprotonáló-dására” kapott eredmény számértéke is jelentősen különbözik az előzőtől (p K = 4,3), és a hidrogénatom disszociációját a 3’-OH-csoportról feltételezik.

A fenti közleményekben ismertetett vizsgálati módszer több esetben nem volt megfelelő a kvercetin és a rutin savi disszociációs állandóinak meghatározására, így a kapott eredmény nem a valós savasságukat jellemzi. Napjainkban az analitikai műszerek fejlett technikai megoldásai viszont kedvező lehetőséget kínálnak a mérések ismételt elvégzésére, hogy a flavon-származékok sav-bázis tulajdonságait korrekt módon lehessen feltárni, illetve disszo-ciációs egyensúlyukat, és a fémionokkal történő kölcsönhatásuk folyamatát helyesen tudjuk értelmezni.