A flavonoidok oldatbeli sajátságainak vizsgálata

Az a tény, hogy a flavon-származékok vízben csak kissé oldódnak, sajnos nem teszi lehetővé a tisztán vizes közegű vizsgálatokat, pedig a biológiai és technológiai folyamatok szempontjából éppen e rendszerek lennének a legérdekesebbek.

Az oldószer kellő megválasztása a flavonoidok megfelelő oldhatósága (és oldatban tartása) szempontjából, valamint a fémionok hidrolízisének, illetve redoxi reakcióinak elkerü-lése miatt egyaránt fontos tényező. A flavonoidok és fémionok kölcsönhatásának vizsgála-tához olyan oldószer kiválasztása volt célszerű, amely biztosítja a kvercetin, rutin és robinetin jó oldódását, és a vizes közeghez hasonlóan protonakceptor - protondonor sajátságú, valamint kevésbé dominál benne a réz(II)ion redoxi jellege. Ezen megfontolások alapján került kivá-lasztásra az etanol:víz rendszer (MOLNÁRNÉ 1997).

A koordinációs kémiai folyamatok nagymértékben oldószerfüggőek, mivel a komplex-képződés elsődleges hajtóereje a fémion és a ligandum közötti kölcsönhatás, amit a szolvatá-ció jelentősen befolyásol. Egyes oldószerek – miként a víz, vagy az etanol is – donorként és akceptorként is reagálhatnak. Ezek oldataiban tehát a reaktánsok (fémion, ligandum) és a

reakciótermék (fémkomplex) egyaránt szolvatálva van. A szolvatáció megváltoztathatja a központi atom koordinációs számát, a ligandumok kötési módját és a keletkező komplex szte-reokémiáját is, ezért az oldószer minőségétől, illetve az oldószerelegyek összetételétől függő-en jelfüggő-entősfüggő-en különböző komplexkémiai eredmény várható.

A spektrofotometriás mennyiségi vizsgálatok megkövetelik a flavonoidok adott hullám-hosszhoz tartozó moláris abszorpciós együtthatóinak, illetve a Lambert-Beer-törvény érvé-nyességi tartományának meghatározását is. A moláris abszorpciós együttható értéke nem csupán a flavonoidok minőségétől függ, hanem a közeg összetételével is változik. Az oldat kémhatása is jelentős szereppel bír, mivel a flavon-származékok disszociációs vagy asszo-ciációs reakciói befolyással lehetnek a fényelnyelés változására. A sav-bázis vagy a komplex-kémiai folyamatok kvantitatív értékeléséhez ezekre az adatokra általában a ligandumok vagy a kialakuló komplexek fényelnyelési maximumának hullámhosszán van szükség.

Az alkalmas oldószer-összetétel behatárolása érdekében vizsgáltam a kvercetin-oldatok spektrofotometriás sajátságát (51. ábra), valamint időbeli változatlanságát különböző etanol:víz arányok esetén. Alacsony etanoltartalom (10 - 30 térfogatszázalék) mellett kb. 1 óra alatt szemmel látható opalizáció alakult ki, amely miatt ilyen oldat a további vizsgálatoknál nem jöhetett számításba.

51. ábra A kvercetin fényelnyelésének változása vizes oldatban az etanoltartalom térfogat-százalékának függvényében (Ckvercetin = 6,35 ⋅10^-5 mol/dm³; 0,1 mol/dm³ KCl /kivétel: 100/; felvétel 90 perc után 10 mm küvettában)

lag kevés etanolt tartalmaz, de már kevésbé érzékeny az összetétel piciny változására. Maga-sabb etanol-koncentráció még kedvezőbb lett volna, mivel a fényelnyelés értéke sokkal kevés-bé függött az összetételtől, azonban nem tette volna lehetővé a komplexkémiai egyensúlyok vizsgálatához szükséges állandó alapelektrolit alkalmazását, mert a sók oldatban tartásához nem elegendő a víztartalom.

Az etanol:víz 1:1 térfogatarányú oldószer-összetétel a későbbiekben a rutin és a robinetin oldatbeli vizsgálatára is alkalmasnak mutatkozott. A fényelnyelési maximumok helye a víztar-talom miatt kis mértékben eltérő az irodalmi értékektől (17. táblázat).

17. táblázat A kvercetin, rutin és robinetin abszorpciós maximumainak helye és intenzitása etanol:víz 1:1 térfogatarányú elegyében (0,2 mol/dm³ KCl) (spektrumok: 5. melléklet)

C [mol/dm³] λ [nm] A (1 cm) λ [nm] A (1 cm) λ [nm] A (1 cm)

kvercetin 6,01 ⋅10^-5 256 1,462 308v 0,496 374 1,444

rutin 6,05 ⋅10^-5 258 1,310 305v 0,535 360 1,127

robinetin 6,69 ⋅10^-5 250 0,905 320 0,774 367 1,489

A Lambert-Beer-tövény érvényességének illusztrálására példaként a kvercetin fényelnye-lési maximumán mért abszorpció 1 cm rétegvastagságra átszámított adatait mutatom be a flavonoid koncentrációjának függvényében (52. ábra).

Megállapítottam, hogy etanol:víz = 1:1 tér-fogatarányú elegyében a Lambert-Beer-tör-vény a flavonoidok széles koncentráció tarto-mányában érvényes. Az abszorpció 5,95⋅10^-6 és 2,85⋅10^-4 mol/dm³ koncentrációk közötti lineáris összefüggése arra enged következtet-ni, hogy ilyen határok között nem következik be változás az oldott részecskék számában.

52. ábra A kvercetin fényelnyelésének változása a koncentráció függvényében 1 cm rétegvastagságra átszámítva (etanol:víz = 1:1 térf. arány; 0,2 M KCl)

Vizsgálataim során több párhuzamos vizsgálatból meghatároztam a kvercetin, a rutin és a robinetin moláris abszorpciós együtthatóját a fényelnyelési maximumok hullámhosszán különböző alapelektrolitok mellett és savas kémhatású pufferoldatban (18. táblázat).

18. táblázat A kvercetin, rutin és robinetin moláris abszorpciós együtthatója semleges és gyengén savas közegben

kvercetin rutin robinetin λ [nm] a [dm³/mol cm] λ [nm] a [dm³/mol cm] λ [nm] a [dm³/mol cm]

256 23340(±0,2%) 258 21877(±0,1%) 250 13530

320 11570

0,2 mol/dm³

KCl 374 23950(±0,3%) 360 18785(±0,1%) 367 22255

257 21715(±0,5%) 258 21780(±0,6%) 0,1 mol/dm³

KAc : HAc

= 4:1 376 22470(±0,3%) 362 18655(±0,3%) Eredmények, következtetések

Több publikáció a kvercetin abszorpciós spektrumának – disszociációból vagy mezo-mériából eredő – összetettségére hívta fel a figyelmet (13. ábra), és ezek alapján szükséges-nek látszott újragondolni a flavonoidok A- és B-gyűrűjéhez rendelt sávok valódi tartalmát.

Méréseim szerint a kvercetin, rutin és robinetin abszorpciós spektruma semleges (kálium-kloridos) közegben teljes mértékben megfelelt az irodalmi adatoknak. A fényelnyelési görbék további elemzése azonban meglehetősen bonyolult képet eredményezett. A spektrumok első és második deriváltjait képezve szembetűnik, hogy sok inflexiós pontot tartalmaznak, és nemcsak a helyi maximumok és minimumok hullámhossz értékei azonosíthatók jól, hanem a vállként jelentkező rejtett csúcsok is (6. melléklet, 7. melléklet, 8. melléklet).

Semleges oldatban a kvercetin fényelnyelése az UV-tartományban összetett csúcsot tartalmaz (6. melléklet), az A-gyűrűhöz rendelhető 256 nm-es abszorpció mellett határozott vállként mutatkozik a 272 nm-es maximum. Az előbb idézett közlemény állítását – miszerint a kvercetin 374 nm-es abszorpciója 367 és 387 nm-es sávokból tevődik össze – az általam használt spektrumkiértékelő program segítségével nem tudtam igazolni, sem biztonsággal cáfolni. A szerzők feltételezése szerint a felhasadás a kvercetin molekula disszociációs egyen-súlya miatt következik be.

A rutin abszorpciós spektrumát hasonló vizsgálatnak vetettem alá, és megállapítottam, hogy az ultraibolya tartománybeli sáv (amit az A-gyűrűhöz szoktak rendelni) ugyanúgy meg-kettőződött, de a 360 nm körüli fényelnyelésnél itt sem mutatkozik határozott felhasadás (7.

melléklet). A kvercetin és a rutin közös flavonoid alapváza következtében inert körülmények

mezomer szerkezet lehetősége – mint azt más szerzők felvetik (ld. 6. ábra) –, illetve a molekulák hidrogénhidas di-merizációja, vagy asszociációja.

53. ábra A hidrogénkötés lehetséges egyensúlya a kvercetin és a rutin molekulájában

A robinetin fényelnyelése viszont lényegesen eltér a kvercetin és rutin abszorpciós spekt-rumától. Az UV-tartományban kb. 210 nm-nél nagyon intenzív abszorpciója van, amelynek a nagyobb hullámhosszak felőli oldalán egy kisebb kiemelkedés mutatkozik 250 nm-es maxi-mummal. A B-gyűrűre jellemző fényelnyelési sávon pedig a kisebb hullámhosszak felőli oldalon (320 nm) található hasonló kis kiemelkedés (8. melléklet). A robinetin molekulájában jelentősen különbözik a hidrogénkötések kialakulásának lehetősége, ami szintén okozhatja az abszorpciós sávok megjelenését.

Vizsgálataimból kiderült, hogy ilyen koncentrációtartományban sem asszociációval, sem disszociációval nem kell számolni a koordinációs folyamatok vizsgálata során. Amennyiben ilyen körülmények között jelentős lenne a kvercetin disszociációja, az befolyásolná az abszorpció linearitását is, mivel az egyre töményebb oldatokban fokozatosan csökkenne a disszociáció foka, ami a fényelnyelés relatív arányát is mérsékelné. Ezt igazolja a kvercetin tömény oldatából készített MALDI-tömegspektrum is (9. melléklet), amely etanol-víz elegy esetén csak kis intenzitású csúcsokat mutatott ugyan, de egyértelműen látszik, hogy az asszo-ciátumnak (dimernek) megfelelő tömegértéknél (600-650 m/z) teljes mértékben hiányzik a jel.

A vizsgálat eredménye azt a véleményemet is alátámasztja, hogy a kvercetin spektrumában az abszorpciós sávok összetettségét nem a molekula kismértékű disszociációja okozza, hanem más szerkezeti magyarázatot kell keresni.