IV. Kutatási eredmények és értékelésük
IV.3. A flavonoidok sav-bázis tulajdonságainak vizsgálata
IV.3.1. A kvercetin szerkezeti változása bázikus közegben
Erős bázis jelenlétében (0,02 mol/dm3 nátrium-hidroxid vagy 0,1 mol/dm3 nátrium-kar-bonát hatására) a kvercetin oldatának fényelnyelése azonosan változik (58. ábra).
58. ábra A kvercetin abszorpciós spektrumváltozása 0,02 mol/dm3 NaOH, majd to-vábbi 0,05 mol/dm3 HCl hatására etanol-víz elegyben
(Ckvercetin = 6,05 ⋅10-5 mol/dm3; 0,2 mol/dm3 KCl)
Először intenzív sárga színeződés (majd zöldessárga és rózsaszín) mutatkozik, melynek gyors eltűnésével párhuzamosan a 256 és 374 nm-es jellemző sávok is csökkennek, helyettük egy új, nagyon intenzív abszorpciós csúcs jelenik meg 315-320 nm körül, amelynek jelleg-zetes válla van kb. 350 nm-nél. A teljes kialakulás után feleslegben adott sav hatására a szín-telen oldat fényelnyelése további hipszokróm eltolódást szenved, és a csúcs intenzitása a sem-legessel összemérhető lesz.
Az erős bázis jelenlétében végbemenő folyamat sebessége nagy, de időben (néhány másodpercen belül) adagolt sav segítségével befagyasztható (59. ábra). A kálium-hidroxid hozzáadása során megfigyelhető volt a kvercetin oldatának zöldessárga és rózsaszín elszíne-ződése, ami a sósav azonnali adagolásával rögtön elszíntelenedett. A három savas közegben felvett görbe izobesztikus pontokban találkozik, ami azt is jelzi, hogy a sav-bázis folyamatok szoros kapcsolatban vannak egymással, két-két fényelnyelő részecske található az oldatban.
59. ábra A kvercetin savas kémhatású oldatban, illetve a lúgos oldat különböző időpontbeli visszasavanyítása után felvett abszorpciós spektruma (Ckvercetin = 5,71 ⋅10-5 mol/dm3; 0,2 mol/dm3 KCl)
Vizsgáltam továbbá a hidroxidion koncentrációjának hatását a kvercetin disszociációs reakcióira. Megállapítható volt, hogy a lejátszódó folyamatok mechanizmusa erősen függött a OH−-ion és a kvercetin (Q) koncentrációarányától. A változások két szakasza volt elkülönít-hető. Alacsony hidroxidion tartalom esetén – ha az [OH−]/[Q] < 2 – az abszorpciós spektru-mok egyértelműen jelzik a disszociáció lejátszódását, míg magasabb arány alkalmazása más
növekvő OH−-koncentráció hatására egyre nagyobb mértékben válnak sárga színűvé. Párhuza-mosan az abszorpciós spektrumon a fényelnyelési sávok fokozatos batokróm eltolódása (276 és 395 nm-re), valamint izobesztikus pontok kialakulása (243, 264, 332, 387 nm) figyelhető meg.
60. ábra A kvercetin abszorpciós spektruma különböző koncentrációjú kálium-hidroxid jelenlétében (Ckvercetin = 5,71⋅10-5 mol/dm3; felvétel 2 percen belül) A folyamat következő szakaszában – amikor a OH−-ion a kvercetinhez képest három-szorosnál nagyobb koncentrációban van jelen – fokozódik a disszociációt követő folyamatok sebessége, és ennek következtében megváltozik az abszorpciós görbék alakja. A növekvő KOH koncentrációval párhuzamosan csökken a 274 és 414 nm-es csúcsok intenzitása, és új fényelnyelési maximum és váll jelenik meg 320 illetve 350 nm-nél, valamint izobesztikus pontok alakulnak ki (288 és 379 nm-en) (60. ábra b.).
A gyengén bázikus közegben lejátszódó folyamatok vizsgálatának kivitelezéséhez puf-fersorozatot állítottam elő KH2PO4 és Na2HPO4 oldatának különböző arányú keverésével, amely biztosította, hogy az eltérő pH-jú oldatokban a flavonoidok különböző mértékű disszo-ciációja megfigyelhető legyen az abszorpciós spektrumok összehasonlítása révén.
A kvercetin különböző pH-jú oldatairól 60-90 másodpercen belül felvett abszorpciós spektrumokon jól látható, hogy a változások azonos módon játszódnak le (61. ábra), mint amit az alacsony KOH-tartalmú oldatoknál lehetett tapasztalni (60. ábra a.). Vagyis a fényel-nyelési maximumok fokozatosan a magasabb hullámhosszak felé tolódnak és egyszerre több izobesztikus pont is kialakul (243, 264, 332 és 387 nm), melyek hullámhossza megegyezik az alacsony KOH-tartalomnál tapasztalt értékekkel.
61. ábra A kvercetin abszorpciós spektruma különböző összetételű 0,013 mol/dm3 KH2PO4-Na2HPO4-pufferoldatokban (Ckvercetin = 5,91⋅10-5 mol/dm3)
Az oldatok pH-jának növekedésével párhuzamosan a spektrumok egyre gyorsabb időbeli módosulása következett be, ami legszemléletesebben a 0,013 mol/dm3 Na2HPO4 tartalmú oldatban (pH = 8,36) mutatkozott meg. Az oldat színe közel 3 óra alatt teljesen kifakult, mi-közben a fényelnyelési görbe is alapvetően megváltozott (62. ábra). Az időbeli folyamat végén kapott abszorpciós spektrum alakja lényegesen különbözik a magasabb koncentrációjú KOH tartalmú oldatok abszorpciós görbéjétől (60. ábra b.). Szembetűnő a 350 nm körüli váll hiánya a kialakuló új sávon (max. 335 nm), valamint a jellegzetes izobesztikus pontok hullámhossza is eltérő (292 és 365 nm, a 288 és 379 nm helyett).
62. ábra A kvercetin fényelnyelésének időbeli változása 0,013 mol/dm3 Na2HPO4
oldatban (Ckvercetin = 5,96⋅10-5 mol/dm3; időpontok: t = 2, 6, 10, 15, 20, 33, 45, 60, 90, 150 és 200 perc)
Eredmények, következtetések
Az etanol-víz elegyben a hidroxid-ion koncentráció függvényében kapott spektrum-sorozat vizuális képe, és jellegzetes pontjai megdöbbentően azonosak az irodalomban közölt, adott pH-jú vizes kvercetin-oldat időbeli változásával (ld. 23. ábra), ami arra utal, hogy lejátszódó folyamatban az etanolnak nincs befolyásoló hatása. Sajnos technikai feltételek hiányában nem tudtam rögzíteni az erős bázis hatására végbemenő (és jellegzetes meggyvörös szín megjelenésével járó) igen gyors folyamat kialakulását.
A kvercetin gyengén bázikus kémhatású oldatában lejátszódó folyamatok a spektrumok alapján jobban elkülöníthetők voltak, és meg lehetett különböztetni a gyors disszociációs lépést, valamint az azt követő, lassabban végbemenő reakciókat.
A disszociáció mértékének növekedésével párhuzamosan a kvercetin A-gyűrűjére jellem-ző sáv áthelyejellem-ződése egyértelműbben megmutatkozik az abszorpciós spektrumokban, mint a B-gyűrűé. Az anion részecske (276 nm) és a nem disszociált kvercetinmolekula fényelnyelése (256 nm) sokkal jobban szeparálódik, mint a kétféle részecske látható tartományba eső sávja.
Az UV-tartományban a növekvő pH-val fokozódó disszociáció (az anion alak koncentrá-ciójának emelkedése) határozottan megfigyelhető. Ezek a spektrumjellemzők kifejezetten alá-támasztják azt a feltételezését, hogy a disszociáló hidrogénion leválása valóban a 7-OH-csoporton megy végbe, és a látható tartományban a sáveltolódást csupán a kvercetin mole-kulájának elektrongerjesztésében együttesen bekövetkező változás idézi elő.
A kvercetin fényelnyelésének időbeli változása a pH ≈ 8,0-8,5 oldatokban (62. ábra) azt mutatja, hogy az anionforma koncentrációja fokozatosan csökken, és a kvercetin jelentős mértékű szerkezeti átalakulása valószínű-síthető. Az anion mennyiségének csökke-nése (276 nm) és a keletkező részecske növekedése (333 nm) egyaránt telítési görbével jellemezhető (63. ábra).
63. ábra A kvercetin fényelnyelésének változása az idő függvényében 0,013 mol/dm3 Na2HPO4 oldatban és a folyamat reakciósebességi állandója
(Ckvercetin = 5,96⋅10-5 mol/dm3)
Az anion koncentrációjának csökkenéséből számított reakciósebességi állandó a folyamat kezdeti szakaszában (kb. 20 perc időtartamig) látszólagosan elsőrendű kinetikájú változást jelez (12. melléklet). Ez azonban az idő függvényében módosul. A vizsgálatok kivitelezésekor tapasztaltak alapján a reakciósebesség jelentős mértékben függ az oldat OH−-ion koncentrá-ciójától is.
A kvercetin átalakulása feltehetően más-más úton játszódik le a hidroxidion koncent-rációtól függően, és a két folyamatban keletkező termék szerkezete spektruma alapján nem azonos. Ezért váratlan eredménye volt a vizsgálatoknak, hogy savfelesleg hatására oldatok spektruma meglepő módon teljesen azonos lesz akár alacsonyabb, akár nagyobb OH−-ion koncentráció váltotta ki az időreakciót (ld. 59. ábra 2 spektrum). A folyamat feltételezett reakciósémáját a molekulaszerkezeti magyarázat fejezetében ismertetem.