IV. EREDMÉNYEK
IV.1. A sejtkapcsoló struktúra alkotórészek expressziójának vizsgálata hepato-pancreato-
IV.1.1. Sejtkapcsoló struktúra alkotórészek expressziója normál májban, cirrhosisban,
IV.1.1.2. Claudinok fehérje expressziója colorectalis carcinomák és ductalis pancreas carcinomák májáttétjeiben, összevetve
carcinomában talált mintázattal.
A claudin-1 immunhisztokémiai reakció membrán pozitivitást eredményezett, mely a hepatocelluláris carcinoma (HCC) sejtekben a trabecularis/glanduláris struktúrákban jellemzően
ductalis pancreas carcinomák májáttétjeinek (PLM) tumorsejtjeiben a sejtek teljes kerületén kimutatható volt a festődés (16. b,c. ábra). A normál és tumor körüli májszövetben az epeutak erős pozitivitást adtak, míg a hepatocyták gyengén pozitívnak bizonyultak, döntően az apikális felszínen (16. d. ábra). A morfometriai kiértékelés alapján a claudin-1 immunfestődés a CRLM csoportban volt a legmagasabb a HCC-hez és a PLM-hez képest (16. a. ábra). A különbségek statisztikailag akkor bizonyultak szignifikánsnak, ha Kruskal-Wallis elemzésből kizártuk a tumor körüli májszövet csoportjait (16. f. ábra; CRLM versus HCC, p=0,032; CRLM versus PLM, p=0,008).
16. ábra Claudin expresszió hepatocelluláris carcinomában (HCC), colorectalis carcinoma májmetasztázisában (CRLM), pancreas ductalis carcinoma májmetasztázisában (PLM), és normál májban (NL). (a, b, c, d) Claudin-1 expresszió HCC-ben, CRLM-ben, PLM-ben és normál májban, a felsorolás sorrendjéPLM-ben. (e, f, g, h) Claudin-2 reakció HCC-PLM-ben, CRLM-PLM-ben, PLM-PLM-ben és normál májban, a felsorolás sorrendjében. (i, j, k, l) Claudin-3 festődés HCC-ben, CRLM-ben, PLM-ben és normál májban, a felsorolás sorrendjében.
(m, n, o, p) Claudin-4 immunhisztokémiai reakció HCC-ben, CRLM-ben, PLM-ben és normál májban, a felsorolás sorrendjében. (q, r, s, t) Claudin-7 festődés HCC-ben, CRLM-ben, PLM-ben és normál májban, a felsorolás sorrendjében. A képek egyforma nagyítással készültek, a méretjelölés: 50 mm.
17. ábra A claudin immunhisztokémiai reakciók morfometriai mérésének eredménye az egyes mintákban. Claudin: (CLDN). A vonalak a csoportok középértékét mutatják. A csillagokkal jelölt kapcsok két csoport közötti szignifikáns különbséget jeleznek (p<0.05). HCC: hepatocelluláris carcinoma, CRLM: colorectalis carcinoma májmetasztázisa, PLM: pancreas ductalis carcinoma májmeasztázisa, SL: környező tumormentes máj, NL: normál máj. A claudin-1 tekintetében a 17./a. ábra a nem tumoros csoportokkal együtt mutatja a Wallis analízis eredményét, míg a 17./f. a nem tumoros csoportok nélkül végzett Kruskal-Wallis analízis eredményét demonstrálja.
A claudin-2 immunfestődés granuláris cytoplasma pozitivitást adott mind a tumorcsoportokban (16. e–g ábra), mind pedig a normál sejtekben (16. h ábra). Mind a három vizsgált tumorcsoportban szignifikáns csökkentést tapasztaltunk a reakció mértékében - illetve az ezt jelző terület százalékos pozitivitásban - a környező májszövethez képest, ahol mind az eputak, mind pedig a hepatocyák intenzív festődést mutattak (16. b ábra).
A claudin-3 IHC reakció a CRLM-ben (16. j ábra) szignifikánsan erősebb membranosus reakciót adott a másik két csoporthoz képest (16. c ábra). A HCC és a tumor körüli májszövetben a
hepatocyták gyenge és elszórt pozitivitást adtak (16. i ábra), míg az epeutak erős festődést mutattak (16. l ábra). A PLM csoportban szintén gyenge és fokális claudin-3 szignál volt detektálható az esetek többségében (10/15 minta, 16. k ábra).
A claudin-4 IHC reakció mind a CRLM, mind pedig a PLM csoport mintáiban erős membrán pozitivitást adott (16 n,o ábra) és statisztikailag nem mutatkozott különbség e két csoport között (16 d ábra). Ezzel éles ellentétben a claudin-4 fehérje sem a HCC tumorsejtekben, sem pedig a normál hepatocytákon nem volt kimutatható (16. m ábra), míg normál májban és a tumor körüli májszövetben az epeutak erős pozitivitást adtak (16. p ábra).
A claudin-7 immunisztokémiai reakció a CRLM csoportban (16.r ábra), a másik két vizsgált csoporthoz képest szintén szignifikánsan emelkedettnek bizonyult (17. e ábra). A 15 PLM minta
Mindhárom tumorcsoportot figyelembe véve a HCC közepesen erős 1 és gyenge claudin-2, -3 és -7 pozitivitást adott, míg negatívnak bizonyult claudin-4-re. A CRLM-t ezzel ellentétben erős claudin-1, -3, -4, és -7 festődés jellemezte, míg gyenge claudin-2 pozitivitás volt kimutatható.
A PLM mintákban erős claudin-4 IHC reakciót detektáltunk, a claudin-1, -2, -3, és -7 festődés azonban közepesen vagy gyengén volt pozitív.
Az alacsonyabban differenciált, magasabb grade-el rendelkező HCC-k a claudin-1 fehérje expresszió növekvő tendenciáját mutatták, de ez nem bizonyult szignifikánsnak. A többi vizsgált claudin és a HCC grade-k között nem találtunk összefüggést (18. ábra)
18. ábra A claudinok (CLDN) immunhisztokémiai reakcióinak morfometriai kiértékelése a hepatocelluláris carcinoma (HCC) grade-k szerint. A vonalak a csoportok középértékeit jelzik.
A relatív mRNS expresszió real-time RT-PCR vizsgálata a claudin mRNS termelődésben döntően az immunhisztokémiai vizsgálattal a fehérje expresszióban talált különbségekhez hasonló eltéréseket detektált a vizsgálat csoportok között. Referencia génként a β-actint használtuk. (19.
ábra). A claudin-3 és -4 mRNS expresszió az IHC morfometriához a CRLM csoportban szignifikánsan magasabb különbséget talált a tumor körüli májszövethez és a HCC-hez képest is.
Hasonlóan magasabb claudin-3 expresszió volt látható CRLM-ben a PLM csoporthoz képest. Ezen felül a CRLM csoportban a claudin-7 mRNS expresszió szignifikánsan magasabb volt a tumormentes májszövethez és a PLM-hez képest is, míg ennek a claudinnak a termelésében a HCC és a CRL nem mutatott eltérést. A morfometriai eredményekhez hasonlóan a HCC-ben és CRLM-ben észlelt claudin- 2 szintek alacsonyabbak voltak a tumormentes májban mért szintekhez képest, és ez a HCC-vel való összevetésben szignifikánsnak is bizonyult, míg a PLM csoportban a claudin-2 mRNS expresszió nem mutatott csökkenést a környező májszövethez képest. Az mRNS expresszió az immunhisztokémiával észlelt fehérje termeléshez képest a claudin-1 esetében mutatta a leglényegesebb eltérést, mely a CRLM csoportban a várt, emelkedett expresszió helyett szignifikánsan csökkent volt a HCC-hez és a környező májszövethez képest. Hasonlóan, a PLM csoport alacsonyabb claudin-1 mRNS expressziót mutatott a HCC-hez és a környező májszövethez viszonyítva. Az mRNS expresszió nem adott összefüggést a HCC-k differenciáltságával (20. ábra).
19. ábra A claudinok (CLDN) β-actinhoz viszonyított relatív mRNS expressziójának különbségei. A csillagokkal jelölt kapcsok két csoport közötti szignifikáns különbséget jeleznek (p<0.05). Fehér oszlopok: hepatocelluláris carcinoma (HCC), fekete oszlopok:
colorectalis carcinoma májmetasztázisa (CRLM), Pontozott oszlopok pancreas ductalis carcinoma májmeasztázisa (PLM), Vízszintesen csíkolt oszlopok: környező tumormentes máj (SL), ferdén csíkolt oszlopok: normál máj (NL).
20. ábra A claudinok (CLDN) b-actinhoz viszonyított relatív mRNS expresszióinak különbségei a hepatocelluláris carcinoma (HCC) gradek szerint.
Összefoglalva: A CRLM mintákban erős claudin-3 és -7 immunohisztokémiai pozitivitást észleltünk, mely a HCC és PLM csoportokhoz képest szignifikánsan magasabbnak bizonyult.
A claudin-1fehérje szintén erős IHC pozitivitást adott a colorectalis carcinoma májáttétjeiben, míg a PLM és a HCC alacsonyabb expressziót mutatott. A CRLM és PLM csoportok egyaránt erős claudin-4 pozitivitást mutattak, míg a claudin-4 immunreakció gyakorlatilag negatív volt HCC-ben.
A claudin-2 IHC reakció erősen pozitív volt a tumormentes májszövetben, míg a tumorok ehhez képest szignifikánsan gyengébb termelődést mutattak. Az mRNS expresszióban talált különbségek nagyrészt megegyeztek az immunhisztokémiai kiértékelés során kapott eredményekkel.