Claudin expresszió endocrin és exocrin pancreasban

Célkitűzésünk volt a claudin expressziós mintázat feltérképezése a normál exocrin és endocrin pancreasban valamint az exocrin és endocrin carcinomákban, ezáltal feltárva a claudin expressziós profil hisztogenezis specifikus vonásait és a daganattípusokat jellemző különbségeket.

Normál pancreas claudin fehérje expressziója

A vizsgált claudinok a claudin-2 kivételével lineáris, membranosus expresziót mutattak. A claudin-2 IHK reakció citoplazmatikus granuláris pozitivitást adott. Amíg a claudin-1 mind az acinusokban, mind a ductális hámsejtekben kimutatható volt, addig a az endocrin sejtek negatívak voltak (42. ábra a, b). A claudin-2 csak a ductusokban volt detektálható. (42. ábra c, d). A claudin-3 fehérje a pancreas minden hámelemében expresszálódott: acinusokban, ductusokban és az endocrin sejtekben. (42. ábra e,f).

42. ábra CLDN-1, -2 és -3 expresszió normál pancreas ductusokban, acinusokban és az endocrin Langerhans szigetekben; a, b:

claudin-1, c, d: claudin-2, e, f: claudin-3. (600X) csillag: acinus, nyílhegy: endocrin sejtek, nyíl: ductus sejtek. A ductusok claudin-1, -2 és -3, az acinusok CLDN-1 és -3 pozitivitást, míg az endocrin sejtek csupán CLDN-3 pozitivitást mutattak.

A claudin-4 az acinusokban és a ductusokban egyaránt detektálható volt, de a Langerhans szigetek negatívnak bizonyultak (43. ábra a,b). A claudin-7 fehérje a claudin-3-hoz hasonlóan az acinaris, ductalis és endocrin sejtes kimutatható volt IHK-val. (43. ábra c, d). A ductusok sejtkapcsoló struktúrái tehát claudin-1, -2, -3, -4 és -7 fehérjét expresszálnak, míg az endocrin sejtekben csak claudin-3 és -7 mutatható ki. Az acináris sejtek a ductusokhoz hasonló expressziót mutatnak, de a claudin-1, -3, -4, és -7 pozitivitás mellett claudin-2 nem mutatható ki (13. táblázat).

13. táblázat Claudin expressziós mintázat normál pancreasban.

Claudin altípus Acinus sejtek Ductus sejtek Endocrin sejtek

CLDN-1 pozitív pozitív negatív

CLDN-2 negatív pozitív negatív

CLDN-3 pozitív pozitív pozitív

CLDN-4 pozitív pozitív negatív

CLDN-7 pozitív pozitív pozitív

43. ábra Normál ductusok, acinusok és Langerhans szigetek claudin-4 és claudin-7 fehérje expressziója; a, b: 4, c, d: CLDN-7. (600X) csillag: acinus, nyílhegy: endocrin sejtek, nyíl: ductus sejtek. A CLDN-4 és -7 fehérje a ductusokban és acinusokban is pozitivitást ad, azonban a Langerhans sziget sejtjei CLDN-4 negatívak és CLDN-7 pozitívak.

Exocrin ductalis carcinomák és endocrin daganatok vizsgálata immunhisztokémiai módszerrel

Az adenocarcinomák claudin expressziója intratumoralisan nem mutatott nagy mértékű eltéréseket. Kifejezett, membranosus, diffúz claudin-1 (44. ábra a) és -4 (45. ábra a) pozitivitást detektáltunk az összes vizsgált adenocarcinomában. A claudin-2 a tumorok 45%-ában (9/20) adott granuláris, citoplazmatikus pozitivitás (44. ábra c). A claudin-3 ellenes antitest egyik tumorban sem adott reakciót (44. ábra e). Claudin-7 minden adenocarcinomában pozitív reakciót adott, de ez focalis és változó mértékű volt. pozitivitást kaptunk a reakció során (45. ábra c). A legerősebb

fehérje expressziót a CLDN-4 mutatta. Az expresszió mértéke nem mutatott szignifikáns eltérést az eltérő differenciáltságú Grade I, II és III-as tumorok között.

Az endocrin daganatokban a claudinok expressziója az exocrin tumorokhoz hasonlóan intratumoralisan homogénnek bizonyult. Claudin-2 pozitivitást mindössze egy esetben (1/20 – 5%) találtunk (44. ábra d). A CLDN-3 (44. ábra f) és -7 (45. ábra d) IHK reakció minden vizsgált endocrin daganatban erős pozitivitást adott. Az exocrin tumorokkal szemben az endocrin daganatokban claudin-1 (44. ábra b) és claudin-4 (45. ábra b) pozitivitást egyik tumorban sem találtunk. A claudin expresszióban a benignus, bizonytalan természetű és malignus daganatok között nem találtunk szignifikáns eltérést.

44. ábra Exocrin adenocarcinomák és endocrin daganatok vizsgálata során kapott CLDN-1, -2 és -3 expressziós mintázat. a-c, e-f:

600X, d: 1000X. Az exocrin daganatokban CLDN-1 (a) és -2 (c) pozitivitás látható, a CLDN-3 (e) reakció negatív. Az endocrin

45. ábra Exocrin adenocarcinomák és endocrin daganatok CLDN-3 és -7 expressziós mintázata (a-c): 600X. Az adenocarcinomák CLDN-4 (a) és CLDN-7 (c) reakcióval pozitívak, míg az endocrin tumorok CLDN-4 (b) ellenes immunhisztokémiai reakció során negativitást mutatnak, viszont a CLDN-7 (d) reakció pozitív.

Az exocrin és endocrin daganatokban a claudin-1, -2, -3, -4 és -7 immunhisztokémia kiértékelésének eredményét és az egyes esetek megoszlását 46. ábra mutatja be. Az exocrin és endocrin tumorok expressziós profiljában a legjellemzőbb eltérések tehát a CLDN-1, -3 és -4 fehérjék esetében voltak megfigyelhetőek, melyek differenciáldiagnosztikai értékkel bírhatnak. Az exocrin ductalis pancreas carcinomák erőteljes claudin-1 és claudin-4 immunhisztokémiai pozitivitást mutatnak és negatívak claudin-3-ra, míg az endocrin daganatok claudin-3 fehérje expressziója erőteljes, de nem detektálható bennük claudin-1 és claudin-4. Az endocrin tumorok a CLDN-7 fehérjét jelentősen erősebb mértékben termelik az exocrin tumorokhoz képest.

46. ábra Immunhisztokémiai reakciók során kapott CLDN expressziót mutató értékek az exocrin és endocrin pancreas tumorokban. Egyenes vonal mutatja a középértéket.

Az exocrin és endocrin tumorok vizsgálatakor az egyes csoportokban detektált claudin fehérje expresszió kiértékelésekor kapott értékeket Mann-Whitney U teszt alapján vetettük össze (47. ábra, 14. táblázat). Az endocrin carcinomákban a tumorsejtek szignifikánsan magasabb mértékben mutatnak CLDN-3 és -7 pozitivitást, mint a ductalis exocrin carcinomák daganatsejtjei, azonban az adenocarcinomákban szignifikánsan nagyobb a CLDN-1, -2, és -4 fehérje expresszió pozitivitása. A legnagyobb szignifikanciájú (<0,0001) eltérést a CLDN-1, -3 és -4 esetében láttuk, a claudin-1 és -4 fehérjét az endocrin tumorok, míg a claudin-3-t az exocrin tumorok egyáltalán nem expresszálják.

14. táblázat Exocrin adenocarcinomákon és endocrin pancreas tumorokon végzett immunhisztokémiai reakciók szemikvantitatív analízise

Claudin altípus Exocrin Endocrin p érték

CLDN-1 3,8 ± 0,3 0,0 ± 0,0 <0,0001*

CLDN-2 1,3 ± 0,4 0,2 ± 0,2 0,0268*

CLDN-3 0,0 ± 0,0 3,3 ±0,3 <0,0001*

CLDN-4 3,9 ± 0,4 0,0 ± 0,0 <0,0001*

CLDN-7 2,6 ± 0,4 4,9 ± 0,1 0,0003*

47. ábra Exocrin adenocarcinomákon és endocrin pancreas tumorokon végzett immunhisztokémiai reakciók szemikvantitatív analízise. A megadott értékek a claudin expresszió középértékét ±standard hibát (mean ± S.E.) jelölik. CLDN: claudin; p:

szignifikancia, *: szignifikáns eltérés.

Az exocrin daganatok szignifikánsan magasabb mértékben termelik a CLDN-1, -2 és -4 fehérjéket, ellenben az endocrin tumorokban szignifikánsan nagyobb a CLDN-3 és -7 fehérje expresszió látható.

A claudin-1, -2, -3, -4 és -7 mRNS expresszió endocrin daganatokban és exocrin adenocarcinomákban

A ductalis adenocarcinomák és endocrin tumorok csoportjainak reprezentatív mintáinak mRNS expressziós analízise a vizsgált csoportok között az immunhisztokémiai reakciók eredményeihez hasonló különbségeket tárt fel. Az eredményeket a 48. ábra mutatja be. Az elvégzett RT-PCR vizsgálat azt mutatta, hogy a claudin-1, -2 és -4 mRNS expressziója a pancreas ductalis carcinomákban magasabb volt az endocrin tumorokhoz képest: CLDN-1: 2,28-szoros különbség, CLDN-2: 6,398-szeres különbség, CLDN-4: 2,796-szeres különbség). Tehát a vizsgált claudinok

Exocrin Endocrin

Expresszió

mRNS expressziója alapvetően az immunhisztokémiai reakciók eredményeivel megegyező irányú különbségeket mutatott, de ezek nem bizonyultak szignifikáns eltéréseknek. Tehát az immunreakciókhoz hasonlóan magasabb, de nem szignifikáns CLDN-3 (2,75-szeres) és -7 (3,678-szeres) mRNS expressziót detektáltunk az endocrin tumorokban az exocrin daganatokhoz képest.

Claudin altípus

CLDN-1 CLDN-2 CLDN-3 CLDN-4 CLDN-7

p érték 0,158 ns 0,116 ns 0,343 ns 0,107 ns 0,7 ns

48. ábra Claudin expresszió kimutatása RT-PCR vizsgálattal exocrin és endocrin daganatokban. A feltüntetett értékek megadják, hogy az exocrin tumorokhoz képest az endocrin tumorok hányszor nagyobb CLDN expressziót mutatnak (ns: nem szignifikáns eltérés).

IV.1.4.2. Tricellulin expresszió detektálása immunfluoreszcenciával normál