A claudin-4 expresszió összehasonlító vizsgálata és differenciáldiagnosztikai értéke a máj

A fehérje expresszió immunhisztokémiai detektálását szöveti microarray-n végeztük. A következő mintacsoportokat vizsgáltuk: normál máj; hepatocelluláris carcinoma; epehólyag tumor; közös epevezeték daganata; ductus hepaticus carcinoma; intrahepatikus, perifériás epeúti daganat;

epehólyag tumor (36. ábra).

Immunhisztokémiai vizsgálattal a normál epeúti hámban a claudin-4 fehérje alacsony/mérsékelt fokú expressziója volt kimutatható. Mind az intrahepatikus epeutakban, mind pedig a nagy extrahepatikus epeutakban membránfestődést tapasztaltunk (37. ábra A). Az intraacináris portális kis epeutakban a nagyobb epeutakhoz képest gyengébb membranózus reakciót detektáltunk (36.

ábra b). A normál máj hepatocytái a claudin-4 immunreakcióra negatívak voltak. (37. ábra B).

36. ábra A claudin-4 immnhisztokémiai vizsgálata szöveti microarray-n (a) A minták szöveti microarray-n belüli lokalizációjának sémás ábrázolása: (1) normál máj (2) hepatocelluláris carcinoma, (3) epehólyag tumor, (4) közös epevezeték daganata (5) ductus hepaticus carcinoma, (6) intrahepatikus, perifériás epeúti daganat (b) epehólyag tumor (c) közös epevezeték tumora (d) hepatocelluláris carcinoma. (e) normál máj Nagyítás: 28X .

37. ábra (A) A nagy extrahepatikus epeút normál biliáris hámjában a claudin-4 IHC membrán festődést ad. (B) Claudin-4 IHC reakció normál májszövetben. A kis epeutak (nyíl) gyenge pozitivitást mutatnak. Az inzert a kis epeút claudin-4 pozitivitását és a hepatocyták negativitását mutatja.

A vizsgált 53 biliáris carcinoma közül 37 jól, vagy közepesen differenciált adenocarcinoma volt

differenciált, közepesen differenciált, vagy rosszul differenciált csoportokba osztottuk. Az immunohisztokémiai vizsgálat eredményét az 1. táblázatban foglaltuk össze. Mind az 53 biliáris carcinoma pozitív immunhisztokémiai reakciót adott a claudin-4 elleni antitesttel, a tumorok sejtjei 100 %-ban membránpozitívitást mutattak. A claudin-4 expresszió mértékében nem volt jelentős különbség a biliáris carcinomák kialakulási helyének különböző anatómiai lokalizációja szerint, jelesül, hogy intrahepatikus, extrahepatikus, vagy epehólyag eredetűek voltak. A differenciáció mértéke sem befolyásolta szignifikánsan a claudin-4 IHC reakciót, mind a rosszul, mind pedig a jól differenciált carcinomák kifejezett festődést adtak a claudin-4 elleni antitesttel (38. ábra A., B. ). A reakció membránpozitivitást adott, kifejezett „lépesméz” mintázattal (38. ábra A., B. ). Ezzel ellentétben a hepatocellularis carcinoma minták egyike sem mutatott claudin-4 festődést (38. ábra C. és D. ).

38. ábra : Intenzív claudin-4 membránfestődés a közös epevezeték carcinomájában: (A.) nagyítás: 150 X; (B.): nagyítás: 400 X.

A hepatocelluláris carcinoma nem mutat claudin-4 fehérje expressziót IHC vizsgálattal: (C.) nagyítás: 150 X; (D.): nagyítás: 400 X

A normál epeutak mindegyike CK-7 és CK-19 pozitív volt, az anatómiai elhelyezkedéstől függetlenül. A citokeratin-7 expresszió csaknem mindegyik epeúti carcinomában, a vizsgált tumorok 92%-ában jelen volt (49/53): 22 (96%) epehólyag tumor, 13 (100%) közös epevezeték tumor, 9 (90%) ductus hepaticus carcinoma és öt (71%) intrahepatikus (perifériás) epevezeték tumor bizonyult pozitívnak. A vizsgált 50 hepatocelluláris carcinoma eset közül 17 (34%) mutatott fokális CK-7 pozitivitást (12. táblázat).

Az epeúti tumorok többsége (83%) CK-19 pozitivitást mutatott: 20 (87%) epehólyag carcinoma, 11 (85%) közös epevezeték tumor, 8 (80%) ductus hepaticus carcinoma és 5 (71%) intrahepatikus epeúti carcinoma. A HCC nem mutattak CK19 festődést (12. táblázat).

A CK20 expresszió 14/53 epeúti tumorban (26%) volt kimutatható: 7 (30%) epehólyag tumor, 4 (31%) közös epevezeték tumor, három (30%) ductus hepaticus carcinoma bizonyult pozitívnak, míg egyik intrahepatikus (perifériás) epevezeték tumor sem mutatott festődést. Ezzel ellentétben a CK-20 expresszió csak két (4%) HCC esetben volt kimutatható (12. táblázat). A CKCK-20 festődés sem a normál extrahepatikus, sem pedig a normál intrahepatikus epeutakban nem volt kimutatható. A HSA pozitivitás a hepatocelluláirs carcinoma esetek többségét (43/ 50, 86%) jellemezte, bár az epeúti carcinomák egy kis része (4/53, 8%) szintén mutatott pozitivitást, ezen esetek között két epehólyag carcinoma (9%) és két (15%) közös epevezeték carcinoma is szerepelt, fokális HSA pozitivitással (12. táblázat). Az epeúti carcinomák esetében a vizsgált immunhisztokémiai reakciók szenzitivitása és specificitása a következőképpen alakult: 100 % specificitás és 100 % szenzitivitás a claudin-4 esetében, 92% és 66% a CK-7-re, 83% és 100% a CK-19-re, 26 és 96% a CK-20 esetében, míg 8% és 14% a HSA-ra.

A claudin-4 és laminin kettős immunfluorescens detektálása

A claudin-4 strukturális elhelyezkedésének alaposabb feltérképezése céljából kettős immunfluorescens viszgálatokat végeztünk lamininnel. A claudin-4-t zöld színnel, míg a basális membrán komponens laminint vörös színnnel jelöltük és konfokális mikroszkóppal analizáltuk a festődést. A claudin-4 elleni antitest az összes vizsgált esetben erős membránreakciót adott az epeúti tumorsejteken (39. ábra C és D). A jól differenciált epeúti tumorok körkörös membránfestődést adtak, míg a kevésbé differenciált, magasabb grade-del rendelkező tumorokban töredezett, vagy hiányzó membrán-pozitivitás jellemezte a daganatokat (39. ábra C és D ). Egyik vizsgált hepatocelluláris carcinoma esetében sem találtunk claudin-4 pozitivitást.

39. ábra A jól differenciált (A) és a rosszul differenciált (B) biliáris carcinomában egyaránt erős, membranózus claudin-4 festődést detektáltunk. A képbetétek a hematoxilin-eosin festett tumorok reprezentatív területeit mutatják (C), (D): Konfokális lézer mikroszkópiával detektált claudin-4 (zöld) és laminin (vörös) kettős fluoreszcens immunhisztokémiai reakció fagyasztott metszeten. (C): Erős claudin-4 reakció egy magasan differenciált (low grade) epeúti carcinoma mirigyes struktúráiban. A laminin festődés jól mutatja a glanduláris szerkezet határait. D) Egy szolid növekedési mintázatú, alacsonyan differenciált (high grade) biliáris tumor hámsejtjei a low-grade carcinomához hasonlóan erős claudin-4 festődést mutattak. Képbetétek nagyítása: 280X;

(A), (B), (C) és (D): 400X.

A claudin-4 fehérje expresszió (~22 kDa) detektálása Western blot analízissel

A claudin-4 fehérje expresszió immunhisztokémiával kapott eredményének megerősítésére Western Blot analízist végeztünk (40. ábra). Kizárólag az epeúti tumorokban 22 000 Dalton mólsúlyú, erős immunreaktív sávot kaptunk a claudin-4 elleni antitesttel. Claudin-4 fehérje nem volt kimutatható a hepatocelluláris carcinomákban és a normál májban (40. ábra).

40. ábra A Western immunoblot analízis eredményének ábrázolása reprezentatív mintákon: A claudin-4 pozitivitás kizárólag az epeúti tumorokban jelenik meg (nyílhegyek: 2,5 és 7 sávok). A molekulasúly markerek (kDa) fel vannak tüntetve. Az 1 és 4 sávok hepatocelluláris carcinoma minták, míg a 3 és 6 sáv mintái tumor körüli tumormentes májszövetek; a 8 sáv normál májszövet.

NK—negatív kontroll normál májszövetből

Claudin-4 mRNS expresszió vizsgálata

A claudin-4 mRNS szint relatív expressziójának mérésére a béta-actint használtuk referencia génként. A real-time RT-PCR reakcióval a claudin-4 mRNS expresszió szignifikánsan magasabbnak bizponyult az epeúti tumorokban a hepatocelluláris carcinoma csoporthoz (48-szoros emelkedés, p≤0,001 és a normál májhoz (95-szörös emelkedés, p≤0,001) képest (41. ábra). A HCC csoport és a normál máj között a claudin-4 mRNS expresszióban nem mutatkozott szignifikáns különbség.

41. ábra A claudin-4 mRNS expresszió detektálása real-time RT-PCR-el és a vizsgált csoportok egymáshoz viszonyított expressziójának arányának (fold change) ábrázolása. A vizsgált csoportok: epeúti tumorok (CC), hepatocelluláris carcinoma (HCC) és normal máj (NL). A claudin- 4 mRNS expresszió szignifikánsan magasabb az epeúti tumorokban a HCC-hez és a normál májhoz

12. táblázat Immunhisztokémiai markerek összehasonlítása.

IV.1.4. Claudin és tricellulin expresszió hepato-pancreato-biliáris