A vér-agy gát gyulladásos folyamatokban: a TLR2/6 szerepe

A vér-agy gát, és ezen belül az agyi endotélsejtek érintettek lehetnek úgy a központi idegrendszeri, mint az idegrendszeren kívüli gyulladásos folyamatokban. A gyulladásos folyamatokban fontos szerepet játszanak a Toll-szerű receptorok. Egyre több irodalmi adat áll rendelkezésre arra vonatkozólag, hogy a Toll-szerű receptorok nemcsak az immunsejteken fejeződnek ki. Ugyanakkor a mai napig igen keveset tudunk az endotélsejtek, különösen az agyi endotélsejtek Toll-szerű receptorairól. RT-PCR technikával végzett vizsgálataink azt mutatták, hogy a humán agyi endotélsejtek expresszálják a TLR2-t, 3-at, 4-et és 6-ot, míg a patkány sejtek a TLR2-t, 3-at és 6-ot fejezik ki kontroll körülmények között (36. ábra).

36. ábra. A Toll-szerű receptorok kifejeződése humán és patkány agyi endotél sejtekben

Humán hCMEC/D3 sejtvonal sejtjeiből (A), illetve primér patkány agyi endotélsejtekből (B) teljes RNS-t izoláltunk, és polimeráz láncreakcióval a TLR mRNS-ek jelenlétét vizsgáltuk. A képek 5 különböző kísérlet reprezentánsai.

Ezzel jelenlegi ismereteink szerint elsőként írtuk le a TLR6 expresszóját agyi endotélsejtekben. Különböző fertőzéses és gyulladásos folyamatok gyakran társulnak oxidatív stresszel, ezért megvizsgáltuk, hogy az oxidatív stressz miként befolyásolja a Toll-szerű receptorok expresszióját. Vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a 24 órán át tartó 5 µM koncentrációjú DMNQ kezelés hatására mind a négy Toll-szerű receptor mRNS-ének kifejeződése szignifikáns mértékben növekedett: a TLR2, 3 és 4 transzkripciója a kezeletlen sejtek szintjének több, mint ötszörösére, a TLR6-é pedig tízszeresére emelkedett (37. ábra). Mivel sikerült kimutatnunk úgy a TLR2 mind a TLR6 expresszióját (a TLR2 és TLR6 heterodimert is képesek alkotni), megvizsgáltuk, hogy ezen receptorok specifikus agonistája, a zymosan befolyásolja-e a TLR-ek expresszióját.

Zymosan (100 µ g/ml) kezelés hatására úgy a TLR2 mint a TLR6 expressziója megemelkedett, öt- illetve hétszeresére (37. ábra). A többi TLR expressziója változatlan maradt. Megvizsgáltuk két klasszikus gyulladást fokozó citokin, a TNF-α és az IL-1β hatását is a TLR expresszióra. Míg az IL-1β nem befolyásolta a TLR expressziót, a TNF-α többszörösére emelte a TLR2 és a TLR3 expresszióját (a TLR2-t mintegy tízszeresére, a

74

TLR3-at nyolcszorosára) (37. ábra), ami jelzi, hogy a gyulladásos folyamatok jelentősen befolyásolhatják az endotélsejtek TLR ligandumokkal szembeni érzékenységét.

37. ábra. A humán agyi endotél TLR mRNS-ek transzkripciójának indukálása stresszfaktorok által

A konfluens tenyészeteket 5 µM DMNQ-val, illetve zymosannal (100 µg/ml) kezeltük 24 órán keresztül. Kontrollként GAPDH-t használtunk, és az mRNS-ek kezeletlen hCMEC/D3 sejtekéhez képesti relatív kifejeződését ∆∆Ct módszerrel számítottuk ki. A grafikonon ábrázolt eredmények három független kísérlet eredményeinek átlag és szórás értékeit mutatják.

További kísérleteink során azt vizsgáltuk, hogy a TLR2/TLR6 receptorok aktiválása milyen funkcionális következményekkel jár. Vizsgálataink kimutatták, hogy a zymosan jelentősen megnöveli a vér-agy gát permeabilitását úgy a 376 Da molekulasúlyú fluoreszcein, mint a 67 kDa-os EBA számára (38. ábra). Ez a permeabilitás fokozódás még kifejezettebb volt, ha a zymosan kezelés oxidatív stresszel társult (38. ábra).

38. ábra. A zymosan hatása az agyi endotél tenyészetek permeabilitására A primér patkány agyi endotélsejteket zymosannal (100 µg/ml) és zymosan + kezelt csoportok, valamint a kezeletlen sejtek permeabilitása közötti statisztikailag szignifikáns eltéréseket (p<0,05) csillaggal jelöltük.

A zymosan permeabilitást fokozó hatása miatt további figyelmünket a junkcionális fehérjék expressziójára összpontosítottuk. Western-blot analíziseink jelentős, koncentráció függő csökkenést mutattak ki zymosan hatására a szoros kapcsolatok két transzmembrán alkotóelemének, az occludinnak és a claudin-5-nek a mennyiségében, igazolva feltevésünket, hogy a permeabilitás fokozódása mögött az interendoteliális kapcsolatok funkciózavara áll. Más junkcionális fehérjék (ZO-1, cadherin, α- és β-catenin) expressziójában nem következett be változás (39. ábra).

75

Kontroll Zymosan 10 µg/ml Zymosan 50 µg/ml Zymosan 100 µg/ml

cadherin α-catenin β-catenin

occludin claudin-5 ZO-1 β-actin

0 20 40 60 80 100 120

Occludin Claudin-5

Relatív fehérje expresszió

Kontroll

Zymosan 10 µg/ml Zymosan 50 µg/ml Zymosan 100 µg/ml

39. ábra. A junkcionális fehérjék expressziójának változása zymosan kezelés hatására

A hCMEC/D3 tenyészeteket 10, 50 és 100 µg/ml koncentrációjú zymosannal kezeltük 24 órán keresztül. A bemutatott blottok három független kísérlet reprezentánsai. Minden fehérje sáv intenzitását meghatároztuk denzitometrálással, és a β-aktinhoz normalizáltuk. A grafikon a három független kísérlet kezeletlen sejtekhez viszonyított relatív átlag és szórás értékeit ábrázolja. A statisztikailag szignifikáns különbségeket (p<0,05) csillaggal jelöltük.

Mivel a funkcionális tesztek során az oxidatív stressz fokozta a zymosan permeabilitást fokozó hatását, ezért megvizsgáltuk, hogy vajon e kettős extracelluláris hatás milyen módon befolyásolja a szoros kapcsolatok fehérjéinek expresszióját.

Várakozásainknak megfelelően az oxidatív stressz és a zymosan együttes hatására az occludin expressziójának csökkenése még nagyobb volt mint csak zymosan kezelés esetén.

A claudin-5 esetében ez a szinergiás hatás nem volt megfigyelhető, a DMNQ nem volt képes tovább csökkenteni a zymosan által okozott igen jelentős csökkenést (40. ábra). A következő lépésben azt is megvizsgáltuk, miképpen befolyásolja a zymosan és a DMNQ az occludin és a claudin-5 lokalizációját. Kontroll körülmények között konfluens tenyészetekben úgy az occludin mind a claudin-5 ellenanyaggal végzett jelölés a junkcionális fehérjékre jellemző folytonos membránfestést adott. Az occludin membránfestése zymosan kezelés hatására elvesztette folytonosságát, és ez a hatás még határozottabban jelentkezett claudin-5 esetében. DMNQ kezelés (5 µM, 24 óra) hatására a festés szintén mindkét fehérje esetében szakadozottá vált. Az occludin elhelyezkedésében azonban a legkifezettebb változásokat a kombinatív kezelésnél tapasztaltuk, ahol a

76

membránfestés szinte teljes mértékben eltűnt. Ugyanakkor a claudin-5 esetében a kombinált kezelés szinergiás hatása nem volt megfigyelhető (40. ábra).

40. ábra. A junkcionális fehérjék sejten belüli eloszlása és expressziója zymosan és DMNQ kezelések hatására

Az agyi endotél sejtek konfluens tenyészeteit 100 µg/ml koncentrációjú zymosannal, illetve 5 µM DMNQ-val, ezenkívül a két anyag keverékével is kezeltük 24 órán át. A fluoreszcens mikroszkópos felvételek három független kísérlet eredményeinek reprezentánsai (mérce = 50 µm) (A). A fenti módon kezelt sejtekben Western-blot analízissel vizsgáltuk az occludin és claudin-5 expresszióját. Az ábrán három független kísérlet reprezentatív eredményei láthatóak. (B). A Western-blotok denzitometriás analízise. A kontrollhoz viszonyítottan statisztikailag szignifikáns különbségeket (p<0,05) csillaggal, míg a zymosan kezeléshez képesti különbségeket (p<0,05) kettős kereszttel jelöltük (C).

A TLR2/6 aktiválása által előidézett junkcionális komplexum károsodások mechanizmusát a TLR ismert szignalizációs útvonalainak gátlásával próbáltuk feltérképezni. Kimutattuk, hogy az occludin expressziójának csökkenését a MEK inhibitor U0126 teljes egészében kivédte, míg az NFκB (nukleáris faktor κB) PDTC-vel történő gátlása hatástalannak bizonyult. A claudin-5 mennyiségi csökkenését azonban sem az U0126, sem a PDTC nem volt képes megakadályozni arra utalva, hogy a két junkcionális fehérje eltérő szabályozás alatt áll. Western-blot kísérleteinket az immunfluoreszcens vizsgálatok is alátámasztották

Occludin Claudin-5

Kontroll Zymosan 100 µg/ml DMNQ 5 µM Zymosan+DMNQ

occludin

77

(41. ábra). Az U0126 teljes mértékben kivédte a zymosan által kiváltott változásokat az occludin lokalizációjában, azonban a claudin-5 fehérje elhelyezkedésének megváltozását nem akadályozta meg. Ugyanakkor a ZO-1 fehérje sejten belüli elhelyezkedésére nem volt hatással a zymosan kezelés.

41. ábra. A zymosan junkcionális fehérjékre kifejtett hatásának mechanizmusa

A hCMEC/D3 sejteket zymosannal (100 µg/ml) és zymosan + PDTC (NFκB gátlószer, 100 µM), illetve zymosan + U0126 (ERK útvonal gátlószere, 10 µM) kombinációjával kezeltük 24 órán át. Az ábra három független Western-blot kísérlet reprezentatív eredményeit mutatja (A). Az egyes fehérje sávok intenzitását denzitometráltuk és β-aktinhoz normalizáltuk (B). A kontrollhoz viszonyítottan statisztikailag szignifikáns különbségeket (p<0,05) csillaggal, míg a zymosan kezeléshez képest tapasztalt szignifikáns eltéréseket (p<0,05) kettős kereszttel jelöltük. A fenti módon kezelt sejtek immunfluoreszcens vizsgálata (C) (mérce = 50 µm).

78