A dohányfüst egyes összetevőinek hatása a vér-agy gátra

A dohányzás számos káros hatása ismert, azonban a dohányfüst alkotóelemeinek közvetlen hatása az agyi endotélsejtekre még nem kellően tisztázott. A dohányfüst legfontosabb összetevői között vannak a nikotin és a policiklusos aromás szénhidrogének.

Mi elsősorban arra kerestük a választ, hogy ezek a vegyületek befolyásolják-e a paracelluláris permeabilitást, illetve az interendoteliális junkciók felépítésében szerepet játszó fehérjék expresszióját az agyi endotélsejtekben. 100 nM - 100 µM koncentrációjú nikotin kezelés 15 percen, valamint 1 és 5 órán át nem okozott változásokat az agyi endotélsejtek occludin expressziójában. Csak 10 µM vagy annál nagyobb koncentációjú, 24 órán át tartó kezelés eredményezett kisfokú occludin csökkenést a Triton X-100

42. ábra. Az occludin mennyiségi változásai agyi endotélsejtekben nikotin hatására

A sejteket 100 nM - 100 µM koncentrációjú nikotinnal kezeltük 24 órán keresztül (A). A 24 órás kezelés eredményeinek denzitometriás analízise (B). A bemutatott képek három független kísérlet reprezentánsai. A grafikonok három független kísérlet kezeletlen sejtekhez viszonyított relatív átlag és szórás értékeit ábrázolják.

Az occludinhoz hasonlóan viselkedett a ZO-1 is: csak nagy koncentrációjú nikotinnal (10 µM) 5, illetve 24 órán át tartó kezelés eredmenyezett csökkenést. Az adherens kapcsolatok fehérjéi közül a cadherin mennyisége szintén csak 24 órás kezelés után csökkent, a β-catenin szint viszont nem változott (43. ábra).

79

43. ábra. A ZO-1, a cadherin és a β-catenin mennyiségi változásai nikotin kezelés hatására

A sejteket 1 - 10 µM koncentrációjú nikotinnal kezeltük 5 és 24 órán át, majd Western-blottal vizsgáltuk a junkcionális fehérjék mennyiségi változásait. Az ábrán három független Western-blot kísérlet reprezentatív eredményei láthatóak. A grafikon három független kísérlet kezeletlen sejtekhez viszonyított relatív átlag és szórás értékeit ábrázolja. A kontrollhoz viszonyítottan statisztikailag szignifikáns különbségeket (p<0,05) csillaggal jelöltük.

A policiklusos aromás szénhidrogén fenantrén 30 µM koncentrációban az occludin redisztribúcióját okozta a Triton X-100 inszolubilis frakcióból a Triton X-100 szolubilis frakcióba. Hasonló, de kevésbé kifejezett változásokat tapasztaltunk claudin-5 esetében is, míg az α- és β-catenin, valamint ZO-1 mennyisége nem változott. Az 1-metilantracén esetében nem figyeltünk meg változásokat a junkcionális fehérjék kifejeződését illetően, kivéve a claudin-5 mennyiségének csökkenését a Triton X-100 oldhatatlan frakcióban (44.

ábra).

44. ábra. A junkcionális fehérjék mennyiségi változásai fenantrén és 1-metilantracén hatására A konfluens agyi endotél tenyészeteket fenantrénnel (Ph) és 1-metilantracénnel (1-MA) kezeltük (30 µM, 24 óra). Az ábrán három független Western-blot kísérlet reprezentatív eredményei láthatóak. A grafikon három független kísérlet kezeletlen sejtekhez viszonyított relatív átlag és szórás értékeit ábrázolja. A kontrollhoz viszonyítottan statisztikailag szignifikáns különbségeket (p<0,05) csillaggal jelöltük.

80

sejtlizátum IP:β-catenin K Ph

WB

83 –

83 –

130 – kDa β-catenin

α-catenin

cadherin

K Ph sejtlizátum IP:β-catenin

K Ph WB

83 –

83 –

130 – kDa β-catenin

α-catenin

cadherin

K Ph

Az adherens junkciók fehérjéinek interakcióit koimmunoprecipitáció segítségével vizsgáltuk. Eredményeink azt mutatják, hogy a fenantrén nem károsítja a β-catenin - α-catenin és β-α-catenin - cadherin kapcsolatokat (45. ábra).

45. ábra. A fenantrén hatása a β-catenin α-cateninnel és cadherinnel alkotott kapcsolataira

Az agyi endotél sejteket 30 µM fenantrénnal kezeltük 24 órán át. Az immunprecipitálást β-catenin elleni antitesttel végeztük és a precipitált mintákon α-catenin és cadherin antitestekkel Western-blot kísérleteket végeztünk.

Az immunfluoreszcens vizsgálatok megerősítették a Western-blot vizsgálatok eredményeit. 24 órás nikotin kezelés (10 µM) a ZO-1 festés intenzitásának csökkenését eredményezte, amelyhez a membránfestés folytonosságának a felszakadása is társult. A ZO-2 és occludin festés kevéssé változott, és egyáltalán nem változott a claudin-5 lokalizációja. 24 órás kezelés 30 µM fenantrénnal csak kismértékű változásokat okozott a claudin-5, az occludin és a ZO-2 lokalizációjában (46. ábra).

Mivel e vegyületek a dohányosok vérében in vivo körülmények között egyszerre jelennek meg, megvizsgáltuk a nikotin és a policiklusos aromás szénhidrogének együttes hatását is. A junkcionális fehérjék lokalizációja kombinált nikotin és fenantrén kezelés hatására hasonló volt a csak nikotin kezelés után észlelthez: elsősorban a ZO-1 festés intenzitása csökkent és vált szakadozottá, az occludinban és a ZO-2-ben észlelt változások kevesbé voltak hangsúlyosak (46. ábra).

81 Kontroll Nikotin

occludin

claudin-5

ZO-1

ZO-2

Fenantrén

Kontroll Nikotin+Fenantrén occludin

ZO-1

ZO-2

46. ábra. A nikotin és fenantrén hatása a sejt-sejt kapcsolatok alkotóelemeinek sejten belüli elhelyezkedésére

Az agyi endotél sejtek konfluens tenyészeteit 10 µM nikotinnal és/vagy 30 µM fenantrénnal kezeltük 24 órán át, és a fixált sejteket occludin, claudin-5, ZO-1, ZO-2 elleni antitesttel festettük. A nyilak azokat a helyeket jelölik, ahol a fehérjék eltűntek a sejtkapcsoló szerkezetek területéről. Mérce = 100 µm.

A barrier funkcionalitását TEER vizsgálatok segítségével követtük nyomon. E célból az agyi endotélsejteket kollagén IV/fibronektinnel bevont Transwell filtereken tenyésztettük asztrocitákkal kokulturában, és ily módon 200-300 Ohm•cm² ellenállást tudtunk mérni. 10 µM nikotin kezelés nem okozott szignifikáns változást a TEER-ben.

82

Hasonlóan nem tudtunk szignifikáns változásokat kimutatni policiklusos aromás szénhidrogén származékokkal vagy metilantracén és nikotin kezelés kombinációjával sem.

A cigarettafüst számos oxidáns anyagot tatalmaz, amelyek az alveolusok falán keresztül a keringésbe kerülhetnek (Yamaguchi és mtsai., 2007), ugyanakkor a tartós dohányzás jelentős keringési károsodásokkal is jár, ezért dohányzókban a nikotin hatása oxidatív stresszel társulhat. 24 órás nikotin kezelés DMNQ (10 µM) által indukált oxidatív stresszel társulva fokozta a csak oxidatív stressz által kiváltott TEER csökkenést (47A.

ábra). Ehhez hasonlóan a ZO-1 lokalizációjában bekövetkezett változások is erőteljesebbek voltak kombinált kezelés során, mint csak DMNQ vagy csak oxidatív stressz hatására (47B. ábra).

*

0 20 40 60 80 100 120

0 óra 1 óra 2 óra 24 óra

TEER (a kezdeti érték százaléka)

DMNQ Nikotin+DMNQ

Kontroll Nikotin

DMNQ Nikotin+DMNQ

A B

47. ábra. A nikotin és az oxidatív stressz együttes hatása a rezisztenciára és a ZO-1 lokalizációjára Primér agyi endotélsejtek konfluens tenyészeteit kezeltük 10 µM DMNQ-val vagy 10 µM DMNQ-val és 10 µM nikotinnal 24 órán át. Az ábra a transzendoteliális rezisztencia változásait (A) illetve a ZO-1 lokalizációját mutatja (B). Mérce = 100 µm.

A nikotin és policiklusos aromás szénhidrogének által okozott változásokat egyéb fehérjék expressziójában proteomikai analízis segítségével végeztük el. 10 µM nikotinnal, illetve 30 µM fenantrénnal kezelt agyi endotélsejtekből készített homogenátumot vetettünk alá 2D elektroforézisnek, és azokat a fehérjéket, amelyeknek expressziója különbözött a kontrolltól MALDI-MS segítségével azonosítottuk A kapott eredmények a következőképpen foglalhatóak össze. Mindkét hatóanyag változásokat okozott sokk által indukált fehérjékben: a nikotin megnövelte a chaperonin tartalmú TCP alegységek és a Hsp70/Hsp90 organizáló fehérje (Hop) mennyiségét, míg a fenantrén a Hsp90 mennyiségét növelte. Változásokat figyeltünk meg egyes jeltovábbításban szerepet játszó fehérjék mennyiségében is: a nikotin megnövelte a kalcium kötő fehérje 1 mennyiségét, míg a fenantrén csökkentette azt. A nikotin növelte a PICOT fehérje mennyiségét, amely a PKCtéta gátlásán keresztül szabályozhatja a stressz indukálta szignalizációt, a fenantrén pedig a zyxin mennyiségét növelte, amely fokális adhézios plakkokban előforduló fehérje. Úgy a nikotin, mint a fenantrén megemelte néhány replikációban, transzkripcióban és transzlációban szerepet

83

WB: anti-occludin WB: anti-itch WB: anti-claudin-1 WB: anti-itch

IP: anti-occludin IP: anti-claudin-1

játszó fehérje mennyiségét, mint amilyen az Elf4A. Ezen túlmenően a nikotin és fenantrén által indukált fehérjék között voltak metabolikus enzimek is.