A G-fehérjék szerepe agyi endotélsejtekben

A sokféle membránreceptor és transzporter mellett az agyi endotélsejtek komplex jeltovábbító útvonalakkal is rendelkeznek. Korábbi munkáink során kimutattuk, hogy az addig neuron-specifikusnak tartott CAM-PK II is expresszálódik agyi endotélsejtekben, és jellemeztük a PKC különböző izoformáinak expressziós mintázatát is. A G-fehérjék számos jeltovábbító útvonal fontos elemei, az azonban nem volt ismert, hogy milyen típusú G-fehérjék vannak jelen agyi endotélsejtekben. A G-fehérjék expressziójának vizsgálatát primér patkány agyi endotélsejtekben, illetve az RBE4 és GP8 patkány agyi endotélsejt vonalakban Western-blot segítségével végeztük el. Az összes általunk vizsgált Gα alegység (Gsα, Gi1α, Gi2α, Gi3α, Gq/11α és G0α) expresszálódott mindhárom típusú agyi endotélsejtben, csak kismértékű mennyiségi különbségek voltak megfigyelhetőek (16 ábra).

16. ábra. G-fehérjék expressziója az agyi endotélsejtekben A primér agyi endotélsejtekből, RBE4 és GP8 agyi endotélsejt vonalakból készített fehérje homogenátumot SDS gélelektroforézis segítségével elválasztottuk, majd blottolás után a membránokat specifikus ellenanyagokkal inkubáltuk.

A G fehérjék α alegységei közül a Gsα és Gi csoportba tartozók az intracelluláris cAMP szint szabályozásában vesznek részt. Mivel e másodlagos hírvívő molekula részt vehet a paracelluláris permeabilitás szabályozásában, megvizsgáltuk, hogy primér agyi endotélsejtek transzendoteliális elektromos ellenállása (TEER) miként változik cAMP hatására. Már 1 óra kezelés után is észlelhető volt a TEER emelkedése, 6 óra kezelés után a TEER értéke megközelítette a kiindulási érték készeresét (17. ábra).

Gq/11α Gsα Go1,2α Gi1,2α Gi2α Gi3α

primér

RBE4 43 –

30 – 43 –

30 –

GP8 43 –

30 –

kDa Gq/11α Gsα Go1,2α Gi1,2α Gi2α Gi3α primér

RBE4 43 –

30 – 43 –

30 –

GP8 43 –

30 – kDa

59

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250

0 2 4 6 8

TEER (Ohm x cm2 )

Idő(óra)

17. ábra. A cAMP hatása a transzendoteliális elektromos ellenállásra

A szemipermeábilis filtereken tenyésztett konfluens primér agyi endotélsejteket 250 µM CPT-cAMP-vel és 17,5 µM RO-201724-gyel (foszfodiészteráz inhibitor) kezeltük. A TEER-t a cellZscope rendszerrel követtük nyomon.

Szintén a G-fehérjékhez, de az úgynevezett kis G fehérjék családjába tartozik a RhoA is, amelynek legfontosabb effektorai a ROCK1 és ROCK2 (Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1 és 2) (Rho-kináz). Igen aktív szerepet játszik a citoszkeleton szabályozásában, és ebből kifolyólag az interendoteliális kapcsolatok regulációjában is részt vehet. Az interendoteliális kapcsolatokat, illetve a szoros kapcsolatokat szabályozó egyik legfontosabb jeltovábbító molekula a Ca²⁺. Ca²⁺ hiányában a paracelluláris permeabilitás jelentősen fokozódik, az ehhez vezető jeltovábbító útvonalak azonban nem ismertek teljességükben. Kísérleteink során arra kerestük a választ, hogy a RhoA szerepet játszik-e a Ca²⁺ által indukált junkcionális változásokban.

Első lépésben azt vizsgáltuk, hogy extracelluláris Ca²⁺ hiányában milyen morfológiai változásokat szenvednek az agyi endotélsejtek. A kísérleteket atomi erő mikroszkóp segítségével végeztük, ami lehetővé teszi élő sejtek nagy felbontású vizsgálatát.

Megfigyeltük, hogy Ca²⁺ hiányában a sejtek disszociáltak és eltávolodtak egymástól. Ezzel párhuzamosan megnőtt a sejtek magassága is: 1,5 µm-ről 3 µm-re a legmagasabb pontnál.

A folyamat reverzíbilisnek bizonyult: a Ca²⁺ koncentráció visszaállításával a sejtek lelapultak és a közöttük levő szabad felszín eltűnt. A Ca²⁺ hiány okozta morfológiai változásokban szerepet játszott a Rho-kináz, hiszen az Y27632 Rho-kináz inhibitor jelenlétében nem következett be a sejtek disszociációja és magasságbeli növekedése (18.

ábra).

60 KontrollCa2+mentesCa2+visszaadás

(j) (l)

Ca2+mentes + Y27632

(k)

18. ábra. Az extracelluláris Ca²⁺ depléciójának és visszaadásának hatása agyi endotélsejtekre:

morfológiai vizsgálat élő sejteken

Fiziológiás Ca²⁺ koncentrációjú tápfolyadékban tenyésztett agyi endotélsejteket (kontroll: a, b, c) 150 percig Ca²⁺ mentes tapfolyadékban tartottunk (Ca²⁺ mentes: d, e, f), ami után a sejtek visszakapták a fiziológiás Ca²⁺

koncentrációjú médiumot (Ca²⁺ visszaadás: g, h, i), illetve 10 µM Y27632-t tartalmazó Ca²⁺ mentes tápfolyadékban tartottuk őket 150 percig (Ca²⁺ mentes + Y27632: j, k, l). 60x60 µm területű atomierő mikroszkóp magassági kép (a, d, g, j), magassági profil a képeken jelölt vonal mentén (b, e, h, k) és deflexiós képek (c, f, i, l). A nyilak a tenyésztőedény alját jelölik.

61

Kontroll Ca²⁺mentes Ca²⁺visszaadás Y27632

Y27632

Kontroll Ca²⁺ mentes Ca²⁺ visszaadás (a)

Kontroll Ca²⁺mentes Ca²⁺visszaadás Y27632

Y27632

Kontroll Ca²⁺ mentes Ca²⁺ visszaadás (a)

19. ábra. Az Y27632 Rho-kináz inhibitor hatása a junkcionális fehérjék lokalizációjára Ca²⁺ megvonás és visszaadás (Ca²⁺ „switch”) során

Fiziológiás Ca²⁺ tartalmú tápfolyadékban tartott konfluens agyi endotélsejt tenyészeteket (a, d, g, j) 150 percig Ca²⁺ mentes tapfolyadékban tartottunk (b, e, h, k), ami után a sejtek visszakapták a fiziológiás Ca²⁺

koncentrációjú médiumot (c, f, i, l). A kísérleteket 10 µM Y27632 jelenlétében is elvégeztük. A tenyészeteket ZO-1 vagy claudin-5 ellenanyaggal festettük meg. Reprezentatív ábra három független kísérletből. A nyilak a junkcionális festés folytonosságának megszűnését jelölik.

Ezzel párhuzamosan a Ca²⁺ hiány junkcionális változásokhoz is vezetett.

Immunfluoreszcens vizsgálataink igazolták, hogy a ZO-1 és claudin-5 festés szakadozottá vált (19b. és 19h. ábra). A folyamat reverzíbilis volt, a Ca²⁺ tápfolyadékhoz való visszadása után a festés visszanyerte folyamatos jellegét (19c. és 19i. ábra). Y27632 jelenlétében a Ca²⁺ megvonás nem vezetett a ZO-1 és claudin-5 folyamatos membránfestésének felszakadozásához (19e. és 19k. ábra), ami arra utal, hogy a folyamat a morfológiai változásokhoz hasonlóan Rho-kináz függő. A junkcionális fehérjék Ca²⁺

visszaadása utáni visszarendeződését a Rho-kináz gátlószer nem befolyásolta (19f. és 19l.

ábra).

62 Ca²⁺-mentes médiumban tartottuk őket 10 µM Y27632 jelenlétében vagy hiányában (c, d). A sejteket fixálás után Alexa488-jelölt falloidinnal (zöld), anti-ZO-1 ellenenyaggal (piros) és Hoechst 33258-cal (kék magok) festettük meg. Atomierő mikroszkópos felvételek: magassági kép (e), magassági profil (f) és deflexiós kép (g) Ca²⁺-mentes médiumban tartott agyi endotélsejtekről. A nyilak a Ca²⁺-mentes médiumban létrejött aktin gyűrűt jelölik.

Atomi erő mikroszkópos mérésekkel és fluoreszcensen jelölt falloidin segítségével bebizonyítottuk, hogy Ca²⁺ megvonás hatására az aktin-citoszkeleton átrendeződése is bekövetkezett: a sejtek perifériás részén egy körkörös aktin gyűrű jelent meg, amely részben kolokalizálódott a szétesett junkciókkal (20. ábra). Ezen változások létrejöttét is megakadályozta a Rho-kináz gátló.