4. Anyag és módszer
4.2. A selyemmályva (Abutilon theophrasti) allelopatikus hatásának vizsgálata
4.2.1. Laboratóriumi allelopátia bioteszt vizsgálatok
2010 évben laboratóriumi bioteszt (bioassay) kísérletben vizsgáltuk a selyemmályva (Abutilon theophrasti) növény allelopatikus hatását gabonanövények csírázására és növekedésére.
A kísérleteket 2010 szeptemberében és októberében állítottuk be a Pannon Egyetem Georgikon Kar, Növényvédelmi Intézetének laboratóriumában.
Vizsgáltuk a selyemmályva növényből készített csapvizes, acetonos és etanolos kivonatok allelopatikus hatását.
A kivonatkészítéshez a selyemmályva légszáraz föld feletti részeit (légszáraz leveles szár) és légszáraz gyökérzetét használtuk. A növényi részeket finom szemcsenagyságig aprítottuk, majd a szükséges kivonószer hozzáadása után 24 órás extrakciót, áztatást követően a kivonatokat szűrőpapíron keresztül szűrtük, és azonnal felhasználtuk. Az alkalmazott kivonószerek és töménységek a következőek voltak:
1. selyemmályva 2,5g, illetve 5g szárított, leveles szárrész / 100ml csapvíz, etanol, valamint aceton,
2. selyemmályva 2,5g, illetve 5g szárított gyökérzet / 100ml csapvíz, etanol, valamint aceton.
A kísérleteinkhez gabona tesztnövényeket használtunk. Öt gabonaféle [őszi búza (Mv-Magdaléna), őszi árpa (Cartel), tavaszi árpa (KH-Lilla), tavaszi zab (Mv-Pehely) (III.
szaporítási fokú mag), kukorica (PR35F38) (fémzárolt vetőmag)] csírázási és növekedési reakcióit tanulmányoztuk a kivonatok hatására. A tesztfajok kiválasztásának szempontja a hazánkban leggyakoribb gabona-kukorica vetésváltás, ami miatt a tesztnövények szántóföldi körülmények között a selyemmályva talajban lévő növényi maradványainak vizes kivonatával találkozhatnak a csírázáskor és a korai fejlődés szakaszában. Az értékelésbe csak azon fajokat vontuk be, amelyek esetében a csírázási % valamennyi kezelésben elérte az 50%-ot. Így az őszi búza, a kukorica és a tavaszi zab növekedési reakcióit értékeltük.
A kísérletünket 15cm átmérőjű Petri csészékben, 4 ismétlésben, ismétlésenként 25 mag vizsgálatával végeztük redős szűrőpapíron, 15ml kivonatot, illetve a kontroll esetében 15ml csapvizet adagolva Petri csészénként.
A szerves oldószeres kivonatokat a szűrőpapírra való felvitel után evaporáltattuk, majd 15ml csapvízzel hígítottuk.
WTB-Binder KB 115 típusú hűtött légtermosztátban, 20oC-on, sötétben végeztük a csíráztatást.
A kísérleteket tíz nappal a beállítás után értékeltük. Vizsgáltuk a csírázási %-ot és mértük a primer gyökérek, valamint a hajtások hosszúságát. Kapcsolatot kerestünk továbbá a csírázási
% és a hajtások, illetve a primer gyökerek hossza között. A mért adatokat Microsoft Excel 2003 Analysis ToolPak statisztikai program segítségével, egytényezős variancia analízist alkalmazva elemeztük. Értékeltük a kivonatok gátló vagy serkentő hatását.
4.2.2. Üvegházi allelopátia vizsgálatok
2010-ben üvegházi tenyészedényes vizsgálatot állítottunk be a Pannon Egytem Georgikon Kar Növényvédelmi Intézetében, hogy a selyemmályva talajba kevert növénymaradványainak allelopatikus hatását tanulmányozzuk.
A vizsgálatainkat 2010. augusztus 23 és október 18 között végeztük. Két literes űrtartalmú tenyészedényekbe 1kg légszáraz Ramann-féle barna erdőtalajt mértünk be. A bemért 1kg talajhoz a selyemmályva szárított, leveles szárrészeit és szárított gyökérzetét kevertük. A leveles szárrészekből 50g (5%), illetve 100g (10%), míg a gyökérmaradványokból 25g (2,5%), valamint 50g (5%) került bekeverésre. Az alkalmazott kezelések a következőek voltak:
1. Kontroll,
2. 50gramm szárított, leveles szár/kg talaj, 3. 100gramm szárított, leveles szár/ kg talaj, 4. 25g szárított gyökérzet/kg talaj, illetve 5. 50gramm szárított gyökérzet/kg talaj
A talaj-növénymaradvány keverék elkészítése után azonnal vetettük a tesztnövények magvait. A vizsgálatokat 4 ismétlésben végeztük, ismétlésenként 30 mag elvetésével, majd azonos tőszámra való ritkítással (15db növény / tenyészedény).
A kísérleteinkhez gabona tesztnövényeket használtunk. Öt gabonaféle [őszi búza (Mv-Magdaléna), őszi árpa (Cartel), tavaszi árpa (KH-Lilla), tavaszi zab (Mv-Pehely) (III.
szaporítási fokú mag), kukorica (PR35F38) (fémzárolt vetőmag)] csírázási és növekedési reakcióit tanulmányoztuk. Az értékelésbe szintén csak azokat a tesztnövényeket vontuk be, melyek csírázási %-a valamennyi tenyészedényben elérte a minimum 50%-ot. Így az előző kísérlethez hasonlóan az őszi búza, a kukorica és tavaszi zab került kiértékelésre.
Az értékeléseket során négy, illetve nyolc héttel a vetést (augusztus 23.) követően tenyészedényenként 5 tesztnövényt távolítottunk el. Mértük a tesztnövények hajtásainak és gyökérzetének hosszúságát, azok friss- és száraztömegét, valamint a levélterületet.
A mért adatokat Microsoft Excel 2003 Analysis ToolPak programmal, egytényezős variancia analízist alkalmazva statisztikailag elemeztük és értékeltük a selyemmályva különböző, talajba kevert részeinek allelopatikus hatását a tesztnövények fejlődésére.
4.2.3. A selyemmályva (Abutilon theophrasti) fitokémiai karakterének vizsgálata
4.2.3.1. SPME-GC/MS analízis
2009-ben Vörsön árpatarlón 6-8 leveles fenológiai állapotból gyűjtöttünk be Abutilon theophrasti növénymintát.
A leveleket és szárrészeket tartalmazó, barna színű mintákból (szeneszcens növénynek megfelelő anyag) a korábban Héthelyi et al. (2009) által leírt módszerrel csak nyomokban sikerült illóanyagot kivonnunk.
Ezért a műszeres analitikai kimutatásra a leghasználhatóbbnak tartottuk a korábbi tapasztalatatok alapján igen jól bevált szilárd fázisú mikroextrakciót (SPME). Tehát az SPME CombiPAL automata mintaadagoló rendszerhez csatlakozó GC-MS módszert alkalmaztuk.
Így 50-100g minta helyett 0,2-0,5g szárított növényi mintából az illóolaj hagyományos kivonása nélkül, teljesen automatikus rendszerben történt a vizsgálat. 20ml-es lezárt üvegfiolában a mintát 10 percig 60 °C-on inkubáltuk, így a légtérbe jutott illatmolekulák a Fiberen (SPME szálakon) adszorbeálódtak. Az automata rendszer ezután a gázkromatográf készülék injektorába áthelyezi a szálat, ahol a minta termikus deszorpcióval leválik a szálról 1 perc alatt, és az injekciós blokk 2500C hőmérsékleten elpárologtatja, innen kezdve a GC/MS mérés megszokott módon folytatódik. A műszer CombiPAL automata előkészítő rendszerrel
kombinált AGILENT GC/MS tömegspektrométer. A mérések a Semmelweis Egyetem Gyógyszerésztudományi Kar, Farmakognózia Intézetében zajlottak.
4.2.3.2. Vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat (TLC)
Vizsgálatainkban vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel tanulmányoztuk a selyemmályva magvainak fenoloid- és fenolsav-komponenseit. A 2009-ben Keszthelyen gyűjtött magokat durván aprítottuk, majd a metanolos kivonás után 10 µl mennyiséget futtattunk alumíniumfóliára felvitt Merck-szilikagélen. A tesztek: rutozid (= rutin), hiperozid (mindkettő sárga) és klorogénsav (kék) voltak.
A Ph.Hg. VIII. szerint (Országos Gyógyszerészeti Intézet VIII. Magyar Gyógyszerkönyv) végzett módszerrel a magvak össz-tannin tartalmának mennyiségét is meghatároztuk.
2010-ben Keszthelyen 5 fenológiai fázisban - 3-5 leveles (BBCH 14), 6-8 leveles (BBCH 17), 10-12 leveles virágzás előtti (BBCH 55), virágzáskori (BBCH 65), valamint érésben lévő (BBCH 79) - gyűjtöttünk selyemmályva növénymintákat. A gyökérzetet és a szárrészeket különválasztottuk, majd a leveles hajtásokat és gyökérmintákat durva aprítás után szobahőmérsékleten szárítottuk és a felhasználásig szobahőmérsékleten tároltuk. Ezen minták esetében is elvégeztük vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel a növényminták futtatását, 5 µl mennyiséget felcseppentve az alumíniumfóliára felvitt Merck-féle szilikagélre.
A vékonyréteg-kromatográfia értékelését az ún. retenciós faktor alapján végeztük.
Megmértük az előhívott folt távolságát (Dm) és az oldószer által megtett távolságot (Df) (oldószerfront) a felcseppentés helyétől, azaz a starttól. A két mért adat hányadosa a retenciós faktor, vagy Rf, melynek segítségével kiszámítottuk a kimutatott komponensek relatív (%-os) mennyiségét a növényben (Snyder – Kirkland 1979).