Új molekuláris biológiai módszerek
Könyvtárak
2016
Könyvtárak
Genomi, cDNS
Reprezentálják az adott organizmust, vagy annak speciális részét
Készítés:
- Genetikai anyag
- Genetikai anyag vektorban
- Vektoros genetikai anyag adott tároló
organizmusban (szuszpenzióban, vagy plate-en) Keresés:
Genetikai-, vagy fehérje-információ alapján
Inverz PCR:
csak egy ismert szakasz
Integrálódott vírus, transzpzon, stb.
A molekuláris klónozás főbb lépései
Könyvtár- készítés
cDNS, vagy genomi
Kolónia hibridizáció: Keresés könyvtárakban
Klónozás ragadós végekkel
Klónozás tompa
végekkel
Klónozás tompa végekkel +
linkerekkel
Klónozás 2 r. enzimmel: megfelelő irányultság
Klónozás PCR-rel
USER (uracil-specific excision reagent) klónozás
Spéci vektor:
Restrikciós és
„nicking” enzim kezelés
Erdemény:
hosszú ragadós végek, nem komp- lementerek
PCR primerek:
Komplementer
rész, génspecifikus rész, köztük
dezoxi-uracil
Ligálni nem kell!
uracil DNS-glikoziláz endonukleáz VIII
restrikciósan emésztett vektor PCR-fragment
+T4 DNS-polimeráz + dTTP
+T4 DNS-polimeráz + dATP
összekeverés, gazdasejtbe juttatás
3-nukleotidos ligálás-independens klónozás
Ligálás independens klónozás
Vektor: klónozó része speciális
T4 polimeráz:
3’-5’ exonukleáz + 1 fajta dNTP
PCR: primer tervezés PCR, T4 polimeráz (másik dNTP-vel)
topo- izomeráz
topo- izomeráz nyitott
vektor végei
összeligált, transzformációra alkalmas konstrukció
5 perc inkubálás szobahőmérsékleten
PCR-termék
Taq polimerázzal felszaporított
TOPO-klónozás I.
topoizomeráz
topoizomeráz
5’ túlnyúló vég
TOPO-klónozás II.
PCR-termék vektor
vektor
PCR-fragment vagy expressziós klón
donor vektor „entry” klón kivágódott
szelekciós kazetta
inzert inzert
ccdB/
CmR
ccdB/
CmR BP clonase
Gateway klónozás
inzert inzert
ccdB/
CmR
ccdB/
CmR
„entry” klón „destination”
vektor expressziós klón kiszelektálódó
melléktermék LR clonase
cDNS szintézis
3’OH 5’ sapka
3’
3’
3’
3’
hajtű
3’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
cDNS/mRNS hibrid
hőkezelés, vagy lúgos hidrolízis
+ dNTP
+ Klenow fragment
+ S1 nukleáz
ss cDNS
ds cDNS
Második szál átírása I.
Második szál átírása II.
cDNS/mRNS hibrid
3’OH 5’ sapka
3’
3’
3’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
ds cDNS + dNTP
+ RN-áz H
+ E.coli DNS-polimeráz I.
a megmaradó RNS-darabok primerként szolgálnak a polimeráz számára
+ T4 DNS-ligáz
TTTTTTT
CCCCCCCC TTTTTTT
+ terminális transzferáz + dCTP
ss cDNS
+ oligo dG primer + Klenow fragment
CCCCCCCC TTTTTTT
AAAAAAA TTTTTTT
ds cDNS
Második szál átírása III.
3’
3’
3’ 3’
5’
5’
5’
5’ 5’
3’
5’
CCCCCCCC GGGGGGGG GGGGGGGG
3’
3’
3’
5’
CCCCCCCC TTTTTTT
ss cDNS
+ oligo dG primer + Klenow fragment
TTTTTTT
AAAAAAA TTTTTTT
Második szál átírása IV.
3’
5’
5’
5’
5’
5’
AAAAAAA TTTTTTT
3’
5’
PCR
a specifikus primerekkel
AAAAAAA TTTTTTT
3’
5’
CCCCCCCC
CCCCCCCC
CCCCCCCC
CCCCCCCC GGGGGGGG
GGGGGGGG
GGGGGGGG
restrikciós emésztés
GGGGGGGG
5’
3’
+2 µl MuLV Reverse transcriptase 1 hour 42-44 ºC
2. szál szintézis:
RN-ase H, DNA polymerase I, dNTP-k Tompa végek:
T4 polimeráz, dNTP-k
Linkerek (adaptorok):
5’ foszfát: Polinukleotid kináz + ATP + T4 ligáz
Restrikciós emésztés, ligáció Fragment tisztítása:
Oszlopkromatográfia Metiláció:
Specifikus metiláz, SAM
Reverz transzkripció + specifikus cDNS felerősítése:
RT-PCR
végpontos, vagy real time
legalább 1 gén-specifikus primer
Klónokban sokszor 3’ vagy 5’ vég hiányzik:
Specifikus primer tervezés, majd:
Rapid amplification of cDNA ends 5’ RACE
3’ RACE
AAAAAAA
5’ RACE
3’
5’
PCR oligo dT és génspecifikus primerekkel génspecifikus primer
AAAAAAA 5’
AAAAAAA 5’
+ dNTP
+ reverz transzkriptáz
RNS-szál leszedése, + dATP
+ terminális transzferáz
+ oligo dT primer + dNTP
+ Klenow fragment
AAAAAAA TTTTTTT
AAAAAAA TTTTTTT
3’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
AAAAAAA TTTTTTT
emésztés restrikciós
endonukleázokkal mRNS
5’
3’
3’ 5’
3’
5’
3’
3’ TTTTTTT
+ dNTP
+ Klenow fragment
TTTTTTT
3’ RACE
5’
5’
3’
PCR génspecifikus és oligo dT
primerekkel
5’
AAAAAAA
TTTTTTT AAAAAAA
génspecifikus primer
5’
3’
3’
5’
TTTTTTT AAAAAAA
5’
3’
3’
5’
emésztés restrikciós
endonukleázokkal
5’
3’
cDNS
Csak ép mRNS-ből!
Tobacco Acid Pyrophosphatase
