Molekuláris biológiai módszerek
Alapvető technikák
livius@mail.bme.hu
www.protocol-online.org
Izolálás (tisztítás) Elválasztás
Azonosítás Vizsgálat
Manipuláció
(tulajdonságok megváltoztatása)
Ellenőrzés, mérés (kontrollok)
élő minták kezelése
ismeretlen hatású anyaggal
élő minták kezelése ismert
hatóanyaggal (pozitív kontroll) élő minták
kezelés nélkül (negatív kontroll)
biológiai kísérlet
élettani hatások
mérés
manipuláció azonosítás,
vizsgálat izolálás, tisztítás, elválasztás
makro- molekulák
Biológiai anyagok elválasztása
Hajtóerők:
- Nyomás
- Elektromos erőtér
- Gravitációs erőtér
- Hajszálcsövesség
Szűrés, koncentrálás
vírus partikulumok különböző makro- molekuák
szennyeződések
A dialízis elmélete
a zsákon belül a zsákon kívül
Dialízis
Dialízis-kazetták
Kiegyensúlyozás Csapadék ülepítés Sejt(alkotó) ülepítés
Folyadékfázisok elválasztása Gradiens centrifugálás
Centrifugálás
szögrotor kilendülőfejes rotor
Rotortípusok
centrifugális erő
cf.
centrifugális erő
sűrűség- gradiens
minta
cf.
40%
50%
60%
70%
80%
A
B
Sűrűséggradiens ultracentrifugálás
Kromatográfia
kizárásos megoszlási adszorbciós ioncserés affinitás
folyadék gáz
elektroforézis nyomás
hajszálcsövesség
látható, UV, infra fluorescens
radioaktív MS
Molekula
jellege Elválasztás
mechanizmusa
Detektálás
Gélelektroforézis
(méret, alak, töltés)
D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactopyranose
Agaróz + Agaropektin Agarobióz
TAE, TBE, denaturáló
Pulzáló erőterű gélelektroforézis
Akrilamid
19:1 29:1 37,5:1
Poliakrilamid képződése
NATÍV, UREA, SDS-PAGE Protein, DNS (RNS)
pH, stacking 5-20%
dithiothreitol, β-mercaptoethanol, melegítés
APS, TEMED
Poliakrilamid gél
üveglapok spacerek
tömörítő gél szeparáló gél
SDS-poliakrilamid gél készítése
Mozgékonyság = 1/lg molekulatömeg
Fehérje tisztaság, fehérjekomplexek, membránok és sejtalkotók
fehérje-összetétele,
Mutánsok, overexpresszió, stb.
radioaktivitás, WB
coomassie-festés ezüstfestés
