Vegyes kultúrák, mikrobiális

Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások

BIOREAKT 2009-MSc

Struktúra nélküli modellek (Monod-n túl)

BIOREAKT 2009-MSc

B hatása A-ra

A hatása B-re

PÉLDA leírása elnevezése

0 0 Sterptococcus joghurt

Lactobacillus Nincs kölcsönhatás NEUTRALIZMUS

- - Kizárás μ_A> μ_B

crossover

Negatív hatás a

tápanyagok elvételével

KOMPETÍCIÓ

- - Toxin/inhibitor termelésével

okozott kölcsönös negatív hatás

ANTAGONIZMUS

- 0 Antibiotikum termelés

(inhibíció,antibiózis)

Toxin/inhibitor termelésével okozott negatív hatás

AMENZALIZMUS

- + Negatív hatás lízist okozó ágens

termelésével, pozítív hatás a biomassza szolubilizálásával

ECCRINOLÍZIS

+ 0 kénbaktérium(aerob)

H₂S SO₄^2- Desulfovibrio(anaerob) S.cer. Proteus vulgaris

0 + (niacin)

Stimuláló anyag termelése(+) Inhibitor eltávoliítása(+)

KOMMENZALIZMUS

+ + l. KOMMENZALIZMUS

A és B egyidejű jelenléte nem kell

PROTOKOOPERÁCIÓ

+ + ^{ALGA CO2 O2+ CH}

Baktérium CH+O₂ CO₂

l. KOMMENZALIZMUS A és B egyidejű jelenléte kell

MUTUALIZMUS

INDIREKT KÖLCSÖNHATÁSOK

ÁTTÉTELES HATÁS, NINCS FIZIKAI KAPCSOLAT

Kommenzalizmus egy egyoldalú viszony, anikor az egyik populáció úgy módosítja az élőhelyet, hogy az a másiknak kedvező.

Thiobacillus thiooxidansS-ből kénsavat oxidál, ami csökkenti a víz pH-ját és így egy sor más mikrobát távoltart. Oxigéntermelés algák által halálos lehet obligát anaerobokra.

B hatása A-ra

A hatása B-re

példa leírása ^elnevezése

- + Baktérium protozoa B A-val táplálkozik PREDÁCIÓ

- + Baktérium mikrofág A parazita behatol a gazda (A) testébe és annak bioanyagaival táplálkozik

PARAZITIZMUS endo- ekto-

+ +

(ESETLEG 0)

Alga + protozoa Kérődző + bacik

A és B fizikai kontaktusban együtt növekednek

SZIMBIÓZIS

+ - Térért való küzdelem CROWDING

DIREKT KÖLCSÖNHATÁSOK

KÖZVETLEN FIZIKAI KAPCSOLAT A KÉT SPECIESZ KÖZÖTT

Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások

 

1 1

1

Dx μ S x

dt

dx   

^Dx

^μ   ^{S x}

dt

dx   



S S S_c S

 

2 1

1

2 1

2

kimosódás

1 túlnõ

2 kimosódik 2 túlnõ

1 kimosódik

kevert tenyészetek

Vito Volterra - zárt rendszerben élő két speciesz versengésének modellje kemosztát

steady-state - békés együttélés

2:flokkulens, 1:fonalas

Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások

 

   

 

2 2 1

1 c

0 2

2 2 1

1 1 c

0 c

c 2 c

1 c

2 2 2 1

1 1 0

Y x Y

S x S

0 μ x

Y x 1

Y μ S 1

S D

akkor ,

μ S μ S

D D

ha

μ x Y x 1

Y μ S 1

S dt D

dS































Y₁(S₀-S_c)

Y₂(S₀-S_c) X₁

X₂

 

2 1 C

0 1

1

X

Y S Y

S Y

X   

lehetséges X₁,X₂ cc. párok

S₀ nem befolyásolja S_C-t de meghatározza X₁ és X₂-t

Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások

Y₁(S₀-S_c)

Y₂(S₀-S_c) X₁

X₂

lehetséges X₁,X₂ értékpárok

Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások

   

S1 S2

S1 2m

S2 1m

c 1m

2m

S1 2m

S2 1m

c

c c

S1 c

2m c

S2 c

1m

c S2

c 2m

c s1

c 1m

K K

μ K μ K

D és

μ

μ

μ K μ K

S

S : / S

K μ S

S K

μ S

S K

μ S S

K μ S



 



 







 



Ha a MONOD-modell érvényes

szelekció kemosztátban: fertőzés

revertánsok

direkt, irányitott szelekció

Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások

Zsákmány (préda) - ragadozó kölcsönhatások (predáció)

A természetben a predáció a táplálékláncban,

a szén/energiaforrás transzferben jelentős.

természetes ökológiai rendszerek fenntartása,

a gyorsan növekedő specieszek által a táplálék források kimerítésének megakadályozása

Mesterséges rendszer: eleveniszapos biológiai szennyvíztisztítás

protozoák táplálkoznak az egyszerűbb

szubsztrátokat lebontani képes baktériumokkal.

A természetes és a mesterséges öko-rendszerekre jellemző, hogy állandósult állapot ritkán alakul ki, ehelyett inkább visszatérő ciklusosság (oszcilláció)

Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások VOLTERRA - LOTKA modell

dn

dt

 an

  .n n

dn

dt

  bn

   . .n n

n₁ – zsákmány: elsőrendű kinetika n₂ - ragadozó predator növekedése függ az

„ütközések” számától és hatásosságától

effektív hozam

Fajlagos halálozási sebesség (!?) prey

 .n n n  ^a

an



 

 ^{ }

. n n bn n   b

1 2



  

 .

nemtriviális steady/state

dt dn n

1 dt

dy

dt n dy dt

dn dt

n dy dt

dn

n y n

n

y n

n

y n n

y n

1 1s

1

2 2s

2 1

1s 1

2s 2 2

1s 1 1

2s 2 2

1s 1 1















Vezessünk be normált változókat

1s 2

1 1

1

an .n n / : n

dt

dn    dn

dt

  bn

   . .n n

Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások

Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások

 ^{1 y}  ^y

dt a dn n

1 dt

dy

1 2

1 1s

1

  

) 1

( a ay

.y dt ay

dn

y a n n

n n . n n

a n dt

dn n

1 dt

dy

2 1

2 1

1 1

2 2

2s 2

2 1s

1 1s

1 1

1s 1

y y

y



















 

 





2

b 1 y y

dt

dy   

Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások

 ^{1 y}  ^y

dt a dy

1 2

1

 

^b  ^{1 y}

 ^y

dt

dy   

( ) ^{. a  1} _y ^{y }

2



:

C a

y 2 b

y

1 e

e y e

y

2

1

 



 



 



 





C b.y

b.lny a.y

a.lny









dt 0 b dy dt

dy y

b dt

a dy dt

dy y

a

1 2

2 2









megoldás

Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások

n₁ n₂

n_2S

n_1S

Ψ

Δ Φ

Γ

Trajektóriák a fázissíkon lágy oszcilláció Adott C-nél

Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások

n₁

n₂

idõ

Időbeli változások lágy oszcilláció

Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások

 ^{1 y}  ^y

dt a dy

1 2

1

 

 

     

 

 

y határon periódus

a mivel

d

t y a 0 aT

y T ln y

y 1 dt a

dy y

1

1 1

T

0 2 1

1

2 1

1













   

1 1 T y

2 t 0

T

dt illetve visszatérve a dimenziós változókra 1 T n

2 t dt n 0 2s

  T 

Integrációs átlag= steady state

n y n

2s 2 2



Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások

Öljük meg! Mérgezzük mindkét specieszt (róka, nyúl + vadász)

-₁n₁ -₂n₂





 





 

1s

n a

.

+ n b

dn

dt

 an

  .n n

^dn

dt

  bn

   . .n n

Módosul a steady state

10.dia n2 miért pusztul, n1 nő exp végtelenbe…

Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások Egy reálisabb modell: MONOD , kemosztát

1 2 3 4

100 200 300

5

ferm.idõ (óra) ragadozó

limitáló szubsztrát

zsákmány

 

1 2

2 1 2max 2

2

1 2

2 1 2max 2

1

1 1max 1

1

1

1 1max 1

0

n K

n Dn n

dt dn

n K

n n Y

1 S

K Dn Sn

dt dn

S K

Sn Y

S 1 S

dt D dS

 





 

 





 













(_max2= 0,1 h^-1 _max1=0,5 h^-1 K₂=0,25 g/dm³

K₁=0,1 g/dm3

Y₁=0,25 Y₂=0,5 D=0,05 h^-1 S₀=5 g/dm³)

Dictyostelium discoideum E. coli

Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások

0.2 0.4 0.6 0.8

ragadozó (g/dm

) zs ák m ány ( g /dm

)

0 0 0.5 1 1.5

2 2.5

kezdeti feltétel

határ ciklus

Kemény oszcilláció

Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások

határciklus Kezdeti érték

ragadozó

zsákmány

Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások

idő

Plazmid tartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája

2009_MSc

Genetikailag manipulált mikroorganizmusok (GMO)idegen-fehérje termelésének egyik esete a nagyszámú, idegen gént hordozó plazmid

“tevékenység”, e sejtek nagysúlyú “hátizsákot” cipelnek magukkal, ezért lassabban növekednek mint a plazmidot nem tartalmazó sejtek, illetve a tápanyagokra (a limitáló szubsztrátra) vonatkozó hozamok is kisebbek a plazmidtartalmú sejtek esetén.

Érthető ezért a plazmidvesztés nullánál nagyobb valószinűsége, illetve, hogy egy vegyes populációban - amelyben tehát plazmidos és plazmidmentes sejtek együtt fordulnak elő –

a plazmid mentes sejtek túlnövik a plazmidtartalmú sejteket.

plazmid mentes plazmidot tartalmazó

ATP szükséglet 97*10^-16 mol/sejt 163*10^-16 mol/sejt Y_ATP 10,3*10¹³db sejt/mol

29 g/mol

6,1*10¹³ db sejt/mol

26 g/mol

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája

1.Szegregációs instabilitás

2. Strukturális plazmid instabilitás 3. Gazdasejt mutációk

4. Növekedési sebességek különbözőség

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája 1.Szegregációs instabilitás

LCN (low copy number),  20 kópia/sejt

speciális mechanizmus biztosítja a plazmidoknak a replikáció utáni egyenletes megoszlását a leánysejtekben. (par locus [partition]

a plazmidon) HCN (high copy number), > 20 kópia/sejt

plazmidok megoszlása az anya és leánysejtek között véletlenszerű binomiális eloszlást követ:

ritkán

rendszerint

 

P 0 = 2. 1

2 2

c



 

 

C= plazmid replikációs egységek száma

ritkán

rendszerint

Anyasejtek leánysejtek

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája

Példa

40 plazmid egységet tartalmazó sejt.

Annak a valsége, hogy osztódáskor plazmidmentes sejt jön létre, P= 2 ^(1-40) = 1.8*10^-12.

40 plazmidnyi DNS fele dimer, ötöde pedig tetramer M+D+T =40

D = ½(40) = 20 monomer pl. -ekvivalens azaz 10 dimer T = 1/5(40) = 8 monomer pl. -ekvivalens azaz 2 tetramer M = 40-20-8=12 ténylegesen monomer plazmid

együtt replikálódó egységek száma 12+10+2=24.

P=2 ^(1-24) =1.2*10^-7,

Sejtek felében 10 kópia, másik felében 70 (az átlag 40!)

P= 0.5*P(0)₁₀+0.5*P(0)₇₀ =0.5*2 ^(1-10) +0.5*2 ^{( 1-70)} =9.8*10^-4+8.5*10^-22  9.8*10^-4. Az alacsonyabb kópiaszámú sejtek határozzák meg a

plazmidszegregáció gyakoriságát!

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája

2. Strukturális plazmid instabilitás.

Sejten belüli rekombináció: plazmidon kódolt markerek, például az

antibiotikum rezisztencia génje integrálódik a gazdasejt kromoszomális DNS- ébe, ugyanakkor plazmidon történő mutáció miatt a fehérjetermelés képessége megszűnhet. A marker megvan, azt hisszük, hogy – pl. antibiotikum

adagolással - a szelekciós nyomás fenntartásával csak a plazmidhordozók

fognak szaporodni, pedig mivel a fehérjét nem termelõ sejtek megszabadultak a metabolikus “hátizsáktól”, nagyobb fajlagos növekedési sebességük miatt éppen az ilyen rekombinánsok fognak felhalmozódni a tenyészetben.

A sejten belüli rekombináció, és a plazmid mutáció együtt de külön-külön is az idegen fehérjét nem termelők feldúsulásához vezethet.

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája

3. Gazdasejt mutációk - fehérjetermelés képességének a megszűnése.

Ha például a fehérjeszintézis a Lac promoterhez kötött, és a Lac promoter mutációt szenved úgy, hogy a sejt nem rendelkezik ezután laktóz permeázzal, akkor a sejt nem lesz képes az induktor laktóz felvételére és nem lesz képes a fehérjetermelés beinditására.

4. Túlnövés: a gyorsabban szaporodó, idegen fehérjét nem termelő sejteknek a fajlagos növekedési sebességek különbözőségéből eredő túlnövése.

(Ez az előző háromnak is mindíg következménye.)

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája

Plazmidstabilitás befolyásolása Molekuláris biológiai módszerekkel.

*plazmid kópiaszám (50 felett általában stabil, E.colinál a legjobb eredmények 25- 250 nagyságú kópiaszám esetén ).

*promoter erősségének fokozása ( a fehérjetermelés nagyságát meghatározó másik tényezõ)

Leggyakrabban az IPTG-vel (izo-propil--D-tiogalaktozid) indukálható Lac promotert, illetve a hőmérséklet emeléssel (30-ról 42 ^oC-ra)

indukálható pL promotert alkalmazzák.

És...

*szelekciós nyomás fenntartása: antibiotikum adagolás a plazmidtartalmú sejtek szaporodásának fenntartására

Nem alkalmazható nagy léptékben: antibiotikum rezisztencia = antibiotikum lebontása ( állandóan kellene adagolni a drága antibiotikumot).

• többlépcsős kemosztát és kétfázisú szakaszos fermentációs technika.

előbbi: külüböző V->különböző D->különböző 

utóbbi: pL promoter esetén a E.coli-t 30 ^oC-on tenyésztjük (esetleg

antibiotikum jelenlétében) az exponenciális fázis végéig, a hanyatló fázis közepéig, majd megemeljük a hőmérsékletet 42 ^oC-ra. Ekkor a szaporodás gyakorlatilag leáll (lelassul) és a fehérjetermelés elind.

*Kromoszómáról létfontosságú gén plazmidra → csak a plazmidosok életképesek.

*Kisebb plazmidok stabilabbak, együttreplikálódók számának csökkentése

*runaway replikációs plazmidok: 1/sejt →növekedés →indukció a plazmidreplikációra akár 800db/sejt →indukció a fehérjetermelésre.

*

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája

LÉPTÉK HATÁSA

INOKULÁLÁSI SOR: 1. FERDE AGAROS TENYÉSZET 2. 300 ml RÁZOTT LOMBIK

3. 10-12 l LABORFERMENTOR 4. 300-3000 l KISÉRL. ÜZEM

5 50,000-100,000 l TERMELŐ ÜZEM

INOKULUM legyen 3% ---100% 100/3= 33 szoros növekedés

generáció 5

n

33

2

  

Azaz minimális követelmény 5*5= 25 generáció! stabilitása

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája

Annak a valószínűsége, hogy a plazmidhordozó sejtekből ( X+) plazmidmentes jön létre: p.

N_o db sejtből N_o(1-p) plazmidos és N_o(p) plazmidmentes sejt születik.

Az plazmidos sejtek száma a konszekutiv generációk során:

1.generáció N_o + N_o(1-p) = 2 N_o - N_o p = N_o(2-p) anya leány

2.generáció N_o(2-p) + N_o(2-p)(1-p) = N_o(2-p)² 3.generáció N_o(2-p)² + N_o(2-p)²(1-p) = N_o(2-p)³

. .

n.generáció = N_o(2-p)ⁿ

Kinetikai viselkedés

De: a plazmidmentesek is szaporodnak (sőt), bonyolult rekurzív formula!

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája

IMANAKA és AIBA (1981) Feltétel: az X arányos N-nel!

+ -

 

dX

dt 1 p X



  

dX

dt p X X



 

 

1.

2.

 

 

 

 ^{1 p t} 

exp X

p dt X

dX

t p

1 exp X

X

0 0









 

























Megoldható, ha μ és p állandó

(l. Versengő specieszek esetét!!!)

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája

Ae

= B(t) ha

B e a

Ce A

= y 0

B(t) ay

y

at

at at

-

 





 

 

 ^{1 p t}  ⁰

exp X

p dt X

dX

0

  











   ^exp   ^{1 p}  ^t  ^exp   ^t  ^{X exp}   ^t

p 1

X

X

p





  



    







!

Ez a jó!!!

Elsőrendű lineáris difegyenlet általános megoldása

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája

   ^exp   ^{1 p}  ^t  ^exp   ^t  ^{X exp}   ^t

p 1

X

X

p









 

    







 

 ^{1 p t} 

exp X

X



 

f X

X X

X

 X





 



 

 

 

  _{ }   ^{ }  ^{ }  ^{ }

f exp 1 p t

exp 1 p t p

1 p exp 1 p t exp t X

X⁰ exp t

0

 

 

    



 

 

  







 

    

Bevezetés, definiíció:

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája

tenyésztés során keletkezett generációk száma n=⁺t/ln2

plazmidhordozó sejtek metabolikus megterhelését mérő jelzõszám

=^-/⁺

a generációk számának,

a plazmidvesztés valószínűségének, a metabolikus megterhelésnek

a függvényében mutatja a plazmidhordozó sejthányad alakulását a tenyésztési idő (generációk) változásában.

 

 

f 1 p

1 p 2

  

 





f X

X X

X

 X

^ 

 



Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája

Plazmidhordozók hányada a generációk számának függvényében

=-/+

p=0,01

f

1

1.2

1.4

2.0 1

0.5

0

25

0

33 gen. alatt eltűnnek a + sejtek!

 

 

f 1 p

1 p 2 ^{n 1 p}

  

  ^{  }



 ^

f

1

1.2

1.4

2.0 1

0.5

0

25

(0)

33 gen. alatt eltűnnek a + sejtek!

p=0,01

=-/+

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája

Plazmidos sejtek hányadának változása az  függvényében 0.001

p=0.1 0.04

f

=-/+

Stabilis tartomány

Tipikus tartomány 1 25

Mi lesz 25 gen. alatt?

0

1,1

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája

KEMOSZTÁT

   

dX

dt DX (1 p) X dX

dt DX p X X

dX dt

dX dt

dX

dt X X D X X

  

     

 

     

   

   

                     

     



 

 

 



 



































X X

D X

X

X X

D X

X

+

A p-s tag kiesett!

Állandósult állapotban

=-/+

*

**

***

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája



^{ }

  ^

^





X X D X X

Ha α=1 nincs metabolikus megterhelés (csalás a +sejtek javára) +

 D



 

 

 

X

X exp

pDt ,

 

 

   

X

X

X

1 exp pDt

A megfigyelés kezdete

Csökken !!!

Nő!!!

Ha α=1 * ,**,*** Szimultán differenciál egyenletek számítógéppel Megoldhatók.

Gomba növekedés

BIOREAKT-MSc

Gombanövekedés kinetikája

Szubmerz fonalas növekedés - mint baktériumok, Monod kinetika…..

Felületi kétdimenziós növekedés Pellet növekedés

Felületi kétdimenziós növekedés

dt k dr 

Telepsugár növekedési sebessége gyakran állandó kékpenészes sajt

penészes kenyér

penészes növényi részek

penésztelepek Petri csészén

R

R

baktérium

fonalas gomba

BIOREAKT-MSc

Köralakú telep állandó vastagsággal(magasság):

π.h.ρ r

X  ²

Telep magassága Telep sűrűsége

dt rhρ dr

dt 2

dX  

r

2 / 1



 







h r X

dt k dr 

2 / 1

h hkρ X

dt 2

dX 



 



 



 

BIOREAKT-MSc

2 / 1

h hkρ X

dt 2

dX 



 



 



 

integráljuk

^{X }  ^{λt  X}



^{λ  k   πhρ}

A telep tömege négyzetesen nő az időben, míg a sugár lineárisan

Pellet

π.ρ 3 r

X  4 ³

3 1/3

X

3

X t 



 

  

 

A pellet tömege köbösen nő az időben. Kísérletesen igazolt A.nidulans-ra. De…

BIOREAKT-MSc

Pellet Penicillium chrysogenum

Kritikus sugár oxigéntranszfer kritikussá válik.

Penicillium chrysogenum 0,1 mm, A. Nidulans 2,5 mm

autolízis

1,85 mm

0,4 mm C_i = 0

Phanerochete chrysogenum