Index of /oktatas/konyvek/fizkem/Gelek_MSc/bioadhezio_GyarmatiB

(1)

Mukoadhézió: jelenség, jellemzés, alkalmazás

Gyarmati Benjámin

2020. április 23.

(2)

Jelentőség: topikális szerek kimosódása, eltávolítás pislogással, kötőszövetből szisztémás elimináció, gyenge permeabilitás a corneán (szaruhártyán)

A szem felépítése

Epitél réteg (nagy triptofán-koncentráció): a hidrofil hatóanyag-molekulák 90%- át, a lipofilek 10%-át visszatartja

Stroma: hidrofil gélréteg, kb. 90%-a a corneának

100 mm

epitélium Bowman- membrán

Stroma

Descemet- membrán endotélium

lipofil

hidrofil

Khutoryanskiy VV. Mucoadhesive Materials and Drug Delivery Systems: John Wiley & Sons, Ltd; 2014.

2/47

(3)

Mucus réteggel borított, laza védőréteg a szem környezetében, inzertek behelyezése itt valósítható meg

A szem körüli kötőszövet és a könnyfilm

Lipid réteg

Vizes oldat

Mucus

Semleges lipidek (szterol) Poláris lipidek (foszfolipidek) Lipidek

mucin Víz

Membránkötött mucin

Epitél sejtek

3/47

(4)

- Kötőszövet (conjunctiva), szemhéj, könnycsatornák - Szaruhártya

- Elülső és hátulsó csarnok - Üvegtest, retina (érhártya)

Preferált: topikális beviteli mód, szemészeti készítmények 90%-a, de az

alkalmazott dózis 1-3%-a jut át a szaruhártyán, kevesebb mint 1%-a jut el a hátulsó csarnokig

Egyéb lehetőségek: szisztémás bejuttatás (toxikus mellékhatások), intraokuláris út (invazív megoldás)

Epitél réteg: lipofil, gyenge permeabilitás a hidrofil hatóanyagok számára (tovább nehezítik a tight junction-ök)

Stróma: hidrofil, nehéz átjutás a lipofil hatóanyagok számára

Viszonylag gyors átjutás:

logP = 2-3

Terápiás célpontok, hatóanyag-beviteli módok

4/47

(5)

Hatóanyag-bevitel modellezése

Franz-cella (FDA által elfogadott) Nagy különbség in vivo-hoz képzest:

elülső csarnokvíz (250 ul, Franz cella akceptor: 16 ml)

Alkalmazott membránok (ex vivo):

Cornea, sclera, conjunctiva

Könnytf.

Könnyáram Cornea vast.

Cornea ter.

Érzékenység Pislogás 3. szemhéj

Emberi . Marha Patkány

Donor oldal

Akceptor oldal Membrán

5/47

(6)

A tartózkodási idő növelése a cél a szem felszínén

• Viszkozitásnövelő adalékok (könnyezéssel, pislogással lassabb eltávolítás), cellulóz származékok, PVP, PVA, enyhén térhálós PAA, hialuronsav stb.

• In situ gélesedő rendszerek (pl. gellan gum/gellán gumi ionok jelenlétében, poloxamerek hőmérséklet-változás hatására)

Terápiás hatékonyság javítási lehetőségei I

Polimer koncentráció (m/m%)

H őm ér sé kl et ( °C )

6/47

(7)

A tartózkodási idő növelése a cél a szem felszínén

• Mukoadhézió – kölcsönhatás a mucosa és a gyógyszerformula (pontosabban annak valamely kommponense) között

• Nanorészecskék (nagy fajlagos felület)

• Szemészeti inzertek

• Kenőcsök, emulziók – lassú kimosódás a könnyel

• Liposzómák – vízoldható és lipofil hatóanyag szállítása is, szabályozható logP (logD)

• Hidrogél konktakt lencsék

• Penetráció-fokozás (felületaktív anyagok vagy Ca-komplex képzők)

• Pro-drug molekulák alkalmazása

(prosztaglandinok, gyenge permeabilitás, Irritáció (sav csoportok)

Terápiás hatékonyság javítási lehetőségei II

Khutoryanskiy VV. Mucoadhesive Materials and Drug Delivery

Systems: John Wiley & Sons, Ltd; 2014. ^7/47

(8)

Nyálkahártyák a szervezet különböző pontjain

Gyomor Vékonybél Vastagbél

8/47

(9)

Mucin a szervezet különböző pontjain

AFM kép:

3 mm hossz!

Tandemhossz Kromoszóma

Mucin

Gélképző, nem kötött mucinok

Nem gélképző, nem kötött mucinok

Membránkötött mucinok

9/47

(10)

A mucin szerkezete

Nagy molekulatömegű fehérje (tipikusan 0.2-50 MDa) PTS régió (prolin, treonin, szerin) glikozilált

Khutoryanskiy VV. Advances in Mucoadhesion and Mucoadhesive Polymers. Macromolecular Bioscience 2011;11:748-64.

10/47

(11)

Lehetőség erős kölcsönhatásokra: H-híd, diszulfid híd stb., gélszerű állag

A mucin szerkezete, kölcsönhatások

Oligoszacharid egységek

Sialic acid Fehérje lánc

Előforduló összes kölcsönhatás mucin és polimer között:

- Ionos (elektrosztatikus) - Kovalens

- Hidrogénhidas - vdW kölcsönhatás - hidrofób asszociáció

11/47

(12)

Mukoadhézió elméletei

Érintkezési szakasz Konszolidáció 1. Elektrokémiai elmélet 2. Adszorpciós elmélet

3. Nedvesedési elmélet 4. Diffúziós elmélet

5. Törési (szakítási) elmélet 6. Mechanikai elmélet

Érintkezés, duzzadás, nedvesítés

Kötések kialakítása, interpenetráció

Szabad (oldható) mucin Kötött mucin

Epitél sejtek

12/47

(13)

Interpenetráció

Interpenetráció IR ATR kristály

PAA mucin IR Behatolási mélység: 200 nm

Hullámszám (cm

^-1

) Távolság (cm)

V as ta gs ág ( n m ) A bs zo rb an ci a (- )

Jabbari E, Wisniewski N, Peppas NA. Evidence of mucoadhesion by chain interpenetration at a poly (acrylic acid)/mucin interface using ATR-FTIR spectroscopy. Journal of Controlled Release 1993;26:99-108. ^13/47

(14)

Dehidratációs elmélet

Duzzadó (gélesedő) formulák esetén jelentős

Enyhén térhálós poliakrilsavak jól duzzadnak, a nagy víztartalmú mucin gélréteget részben dehidratálja (ozmotikus hatás)

Tabletta

Mucus Víz

Mukóza

Gélesedő formula

Dehidratált mucus

14/47

(15)

A mukoadhéziós kölcsönhatást befolyásoló szerkezeti tényezők - mucin

• Víztartalom: általában 90-98%

• Állag: változhat a viszkózus folyadéktól a lágy gélig (gyomor mucin: pH- függő szol-gél átmenet, védelem az emésztés során!)

• Töltés: erősen savas funkciós csoportok (pK

_a

= 1,0-2,6), fiziológiás körülmények között erős nettó negatív töltés (kivéve gyomor)

• pH:

o Tüdő, orr: 5,5-6,5 o Szem: 7,8

o Száj: 6,2-7,4

o Gyomor: 1,0-7,0 (étkezéstől függ)

o Vagina: 4,0-5,0 (terhesség alatt: 4,0 alatt, menopauza után 7,0 körüli) Gyorsan megújuló réteg: szemben 5-7 perc, légzőrendszerben 10-20 perc, GI traktusban 4-6 óra (átlagosan 200 mikronos réteg)

15/47

(16)

Mucin szerkezet a gyomor nyálkahártyában I

Asymmetric flow field flow fractionation (nagyon széles mérettartományon alkalmazható, nano-mikrorészecskék is)

Transzmissziós elektronmikroszkópia Móltömeg (g/mol)

In te n zi tá s (- )

Maleki A, Lafitte G, Kjøniksen A-L, Thuresson K, Nyström B. Effect of pH on the association behavior in aqueous solutions of pig gastric mucin. Carbohydrate Research 2008;343:328-40.

16/47

(17)

Mucin szerkezet a gyomor nyálkahártyában II

Hidrofób asszociáció

Negatív töltés,

diszpergált rendszer

Pozitív töltés,

diszpergált rendszer

17/47

(18)

Mucin szerkezet a gyomor nyálkahártyában III

Csak erősen savas pH-n newtoni profil

18/47

(19)

1. generáció

2. generáció

Mukoadhezív polimerek

In situ gélesedés Polimer

Mucin ^* ^*

O OH

n

Poliakrilsav (PAA)

* *

O OH

n

Polimetakrilsav (PAM)

O

RO OR

O OR

* *

n

R = H vagy CH₂CO₂H Karboximetil-cellulóz

O^-

O O OH

HO OH

OH Na⁺

Nátrium-alginát

HO O

OH

NH₂ HO O

O OH

HO NH₂

O O

OH

NH₂

HO OH

n

kitozán

Negatív és pozitív töltésű polimerek is lehetnek mukoadhezívek!

Bonengel S, Bernkop-Schnürch A. Thiomers — From bench to market. Journal of Controlled Release 2014;195:120-9.

19/47

(20)

1. generáció

2. generáció

Mukoadhezív polimerek

In situ gélesedés Polimer

Mucin

Bármely első generációs mukoadhezív polimer kémiai módosításával előállíthatóak

(egyéb: lektinek, akrilátok, bakteriális fehérjék)

CH₃

N C N

N CH₃

CH₃

Polymer

OH

O

CH₃ NH C N N CH₃

CH₃

O

Polymer HS

NH₂ COOH

HS HOOC

NH

Polymer

O CH₃

NH C N N CH₃

CH₃

O

O Pol

20/47

(21)

Tioltartalmú polimer előállítása

a) Polikarbonsavak módosítása kismolekulás tiolokkal EDAC segítségével

b) Aminocsoportot tartalmazó kitozán módosítása 2- iminotiolánnal

c) Polietilén-glikol (PEG) és polietilén- imin (PEI) módosítása γ- tiobutirolaktonnal

Amidin kötés

d) Kitozán reakciója izopropil-S-acetil- tioacetimidáttal

Amin kötés e) Hidroxietil- cellulóz reakciója nátrium-perjodáttal és a képződő dialdehid módosítása ciszteaminnal

Brómozás

f) Hidroxietil-cellulóz brómozása LiBr, foszfor-ilid és N- bromo-szukcinimid segítségével, majd módosítása kismolekulás tiollal

Amid kötés

21/47

(22)

Kismolekulás módosítók, reaktivitás

HO O

SH

Merkaptobenzoesav pKa= 6,2

SH

NH₂

4-amino-tiofenol pKa= 6,86

HS OH

O

Merkapto-fenilecetsav pKa= 7,7

HO

O SH

NH O

N-acetilcisztein pKa= 8,2

H2N SH

Ciszteamin pK_a= 8,3

HS OH

O

NH2

L-cisztein pK_a= 8,4

HO N

H

HN

OH O

NH2

O SH

O

Glutation pK_a= 8,8

HS OH

NH₂ O

Homocisztein pK_a= 10,0

O SH

OH

Tioglikolsav pKa= 10,3

> > > >

> > >

>

22/47

(23)

Poliaszparaginsav/poliaszpartamid kémia

OH OH O

O

H₂N N

O

* O

* n

n H⁺

-H₂O

Aspartic acid Polysuccinimide (PSI)

R NH₂

DMF or DMSO

NH NH O

O

NH NH O

O

t u

*

R R

N O

O

*

v Poly(aspartamide-stat-succinimide)

H₂O OH^-

NH NH O

O

NH NH O

O

t u

*

R R

Poly(aspartamide-stat-aspartic acid) OH

NH O

O

OH NH O

O

p q

*

Módosított PSI

Aszparaginsav Poliszukcinimid (PSI) Módosított PSI

Módosított poliaszparaginsav (PASP)/poliaszpartamid

Gyarmati B, Vajna B, Némethy Á, László K, Szilágyi A. Redox- and pH-Responsive Cysteamine-Modified Poly(aspartic acid) Showing a Reversible Sol–Gel Transition. Macromolecular Bioscience 2013;13:633-40.

Németh C, Gyarmati B, Abdullin T, László K, Szilágyi A. Poly(aspartic acid) with adjustable pH-dependent solubility. Acta Biomaterialia 2017;49:486-94.

23/47

(24)

Oxidáció hatására gélesed ő rendszerek

Folytatás: Aysel, Pesta Judit, Csobod Judit

0 200 400 600 800 1000 1200

0.1 1 10 100 1000

oxidation

Storage modulus (Pa)

Time (s)

reduction oxidation

Tiolált PASP Diszulfid híddal térhálósított PASP

Idő (min)

Tárolási modulus (Pa)

Oxidáció Redukció Oxidáció

Oxidáció

Redukció

Gyarmati B, Vajna B, Némethy Á, László K, Szilágyi A.

Redox- and pH-Responsive Cysteamine-Modified

Poly(aspartic acid) Showing a Reversible Sol–Gel Transition.

Macromolecular Bioscience 2013;13:633-40. ^24/47

(25)

A mukoadhéziós kölcsönhatást befolyásoló szerkezeti tényezők – polimer oldalról

• Szilárd formulák

Általános móltömeghatár: 10 000 g/mol, max. 4 000 000 g/mol-ig

(kis móltömeg  gyors oldódás, nagy móltömeg  lassú interpenetráció)

• Félszilárd készítmények

Kenőcsök (Orabase – CMC, zselatin, pektin paraffin bázisban)

Gélszerű készítmények

• Folyadék készítmények

Kitozán tartalmú cseppek valamelyest kötődnek oldatból (kis viszkozitásúból is), de nagy részük az oldható mucinhoz

kötődik, nagy a lemosódás aránya

20 kDa-os polimer

Adhéziós idő (min)

Tiol tartalom nő 

25/47

(26)

Mukoadhézió kolloid tartományon I

Ultrahang

Hidrodinamikai átmérő (nm) Hidrodinamikai átmérő (nm)

Hidrodinamikai átmérő (nm)

Térofgatigyakoriság% Térofgatigyakoriság%

Térofgatigyakoriság%

Albarkah YA, Green RJ, Khutoryanskiy VV.

Probing the Mucoadhesive Interactions Between Porcine Gastric Mucin and Some Water-Soluble Polymers. Macromolecular Bioscience

2015;15:1546-53. ^26/47

(27)

Mukoadhézió kolloid tartományon II

Turbiditás maximum:

aggregátumok kialakulása, majd hígulás

Molekulatömeg- és

szerkezetfüggő kölcsönhatás- erősség

PAA 2 kDa (1), PMAA 100 kDa (2), PAA 450 kDa (3)

Polimer/mucin tömegarány

Turbiditás Entalpia (kJ/mol)

Albarkah YA, Green RJ, Khutoryanskiy VV. Probing the Mucoadhesive Interactions Between Porcine Gastric Mucin and Some Water-Soluble Polymers. Macromolecular Bioscience 2015;15:1546-53.

27/47

(28)

Mukoadhézió kolloid tartományban III

Kölcsönhatás polielektrolitokkal

Kölcsönhatás diszulfidhídon keresztül

Albarkah YA, Green RJ, Khutoryanskiy VV. Probing the Mucoadhesive Interactions Between Porcine Gastric Mucin and Some Water-Soluble Polymers. Macromolecular Bioscience 2015;15:1546-53.

28/47

(29)

Mukoadhézió kolloid tartományban IV

NaCl EtOH

karbamid

Kitozán (szabad amin csoportok) Félig acetilezett kitozán (kevesebb szabad amin csoport)

NaCl karbamid EtOH

Turbiditás Turbiditás

Polimer/mucin tömegarány

Sogias IA, Williams AC, Khutoryanskiy VV. Why is Chitosan Mucoadhesive? Biomacromolecules 2008;9:1837-42.

29/47

(30)

N O

O

* *

n

H₂N

NH O

*

O

*

HN

NH N O

*

O

*

HN

NH NH

O

*

O

*

HN

NH₂

n

n n

N

H₂N N H

H₂N NH₂

DMF PSI DMF

DMF

* HCl

* HCl DME

EE DAB

Poliaszpartamidok kölcsönhatása mucinnal (Orovecz Viki, Szilágyi Barnabás)

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

1,2 DAB

Kitozán PASP

Turbiditás (-)

Polimer/mucin tömegarány (-)

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

-40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40

50 DAB

DME EE Kitozán PASP

Zéta potenciál (mV)

Polimer/mucin tömegarány (-)

Folytatás: Stankovits Gergő (Reading), Erdős Dóra

Orovecz Viktória diplomamunka, Szilágyi B. közlésre beküldött publikáció

30/47

(31)

Mucin + kitozán

Mukoadhézió mérése II

Kitozán kontroll

Ultracentrifuga, dn/dr mérése (törésmutató változása)

Kötött kitozán(%)Kötött kitozán(%)

0,1 M ionerősség

0,2 M ionerősség

Deacon MP, Davis SS, White RJ, Nordman H, Carlstedt I, Errington N, et al. Are chitosan–mucin interactions specific to different regions of the stomach? Velocity ultracentrifugation offers a clue. Carbohydrate Polymers 1999;38:235-8.

31/47

(32)

Fluoreszcens kitozán

Mukoadhézió mérése III – Fluoreszcencia depolarizáció

• Kismolekulák esetén gyors depolarizáció

• Makromolekulák esetén maradó polarizáció, steady-state mérhető

Pol. fény Fluoreszcens jelzés

Gyors rotáció

Lassú rot.

Qaqish R, Amiji M. Synthesis of a fluorescent chitosan derivative and its application for the study of chitosan–mucin

interactions. Carbohydrate Polymers 1999;38:99-107. ^32/47

(33)

Növekvő molekulatömeggel

(jobbra) növelhető a mukoadhézió mértéke (több kölcsönhatási pont)

Mukoadhézió mérése III – Fluoreszcencia depolarizáció

Kitozán: polikation

• Negatív kontroll: albumin

• Pozitív kontroll: dextrán szulfát (polianion)

Polarizáció (%) Polarizáció (%)

Polimer/kitozán arány Mucin/kitozán arány

Qaqish R, Amiji M. Synthesis of a fluorescent chitosan derivative and its application for the study of chitosan–mucin interactions. Carbohydrate Polymers 1999;38:99-107.

33/47

(34)

Mukoadhézió mérése IV – Viszkozimetria

A viszkozitás kapcsolatba hozható az oldatban (szolban) lévő részecskék mennyiségével

η = η

₀

(1+5/2φ)

Rossi S, Ferrari F, Bonferoni MC, Caramella C. Characterization of chitosan hydrochloride–mucin interaction by means of viscosimetric and turbidimetric measurements. European Journal of Pharmaceutical Sciences 2000;10:251-7. ^34/47

(35)

Mukoadhézió számszerűsítése makroszkopikusan

Szakítás

Nyírás

Lehúzás

35/47

(36)

Mechanikai mérések, ex vivo

Szakító vizsgálat

36/47

(37)

Gyomor  vastagbél

51

G am m a- ak ti vi tá s ( C r) Gyomor  vastagbél G am m a- ak ti vi tá s (

51

C r)

In vivo mérések

Harris D, Fell JT, Taylor DC, Lynch J, Sharma HL. GI transit of potential bioadhesive systems in the rat. Journal of Controlled Release 1990;12:55-65., Lehr C-M, Bouwstra JA, Tukker JJ, Junginger HE. Intestinal transit of bioadhesive microspheres in an in situ loop in the rat…. Journal of Controlled Release 1990;13:51-62.

37/47

(38)

In vivo mérések II

MRI képalkotás (Tabletta útja, szétesése) Gd-jelzett mintával

Fluoreszcens jelzéssel mennyiségi elemzés is (prokinetikus szer hatása)

Harris D, Fell JT, Taylor DC, Lynch J, Sharma HL. GI transit of potential bioadhesive systems in the rat. Journal of Controlled Release 1990;12:55-65., Lehr C-M, Bouwstra JA, Tukker JJ, Junginger HE. Intestinal transit of bioadhesive microspheres in an in situ loop in the rat…. Journal of Controlled Release 1990;13:51-62.

38/47

(39)

In vivo mérések III

Gamma kamerás követés (Tc jelzett mikrogyöngyökkel jelölték a formulákat)

Harris D, Fell JT, Sharma HL, Taylor DC. GI transit of potential bioadhesive formulations in man: A scintigraphic study.

Journal of Controlled Release 1990;12:45-53.

39/47

(40)

Nyálkahártya modellek

In vivo és ex vivo mérések: roppant nagy biológiai diverzitás, ex vivo: tárolási problémák

Khutoryanskaya OV, Potgieter M, Khutoryanskiy VV. Multilayered hydrogel coatings covalently-linked to glass surfaces showing a potential to mimic mucosal tissues. Soft Matter 2010;6:551-7 ^40/47

(41)

Nyálkahártya modellek

(Stankovits G., Szilágyi B., Gyarmati B.)

Folytatás: Stankovits Gergő, Pesta Judit

Cook MT, Khutoryanskiy VV. Mucoadhesion and mucosa-mimetic materials—A mini-review. International Journal of

Pharmaceutics 2015;495:991-8. ^41/47

(42)

Nyálkahártya modellek osztályozása I

• Sejtszintű modellek (Caco-2 és HT-29 MTX sejtek)

• Fiziológiás modellek (mucin, lipid és egyéb komponensek)

Mérések: permeabilitás, szintetikus nanorészecskék transzportja (tight junction)

Sardelli L, Pacheco DP, Ziccarelli A, Tunesi M, Caspani O, Fusari A, et al. Towards bioinspired in vitro models of intestinal

mucus. RSC Advances 2019;9:15887-99. ^42/47

(43)

Nyálkahártya modellek osztályozása II

• Mesterséges, egykomponensű modellek

Tisztítás, mucin kinyerése után: standardizálható, kereskedelmi forgalomban is kapható komponensek

Hátrány: egyéb komponensek (lipidek) hiánya, nincs gélképző képesség

• Mesterséges, többkomponensű modellek

Sardelli L, Pacheco DP, Ziccarelli A, Tunesi M, Caspani O, Fusari A, et al. Towards bioinspired in vitro models of intestinal

mucus. RSC Advances 2019;9:15887-99. ^43/47

(44)

Összetett nyálkahártya modell (tüdő)

Pacheco DP, Butnarasu CS, Briatico Vangosa F, Pastorino L, Visai L, Visentin S, et al. Disassembling the complexity of mucus barriers to develop a fast screening tool for early drug discovery. Journal of Materials Chemistry B 2019;7:4940-52.^44/47

(45)

PAMPA: parallel artificial membrane permeability assay

Nyálkahártya modell és permeabilitás

Pacheco DP, Butnarasu CS, Briatico Vangosa F, Pastorino L, Visai L, Visentin S, et al. Disassembling the complexity of mucus barriers to develop a fast screening tool for early drug discovery. Journal of Materials Chemistry B 2019;7:4940-52.

Donor oldal Mucus modell Akceptor oldal PAMPA membrán

45/47

(46)

Összefoglalás

• Mukoadhezív készítményekkel a gyógyszerformák tartózkodási ideje a

szervezet számos területén elnyújtható (nazális, GI, szemészeti, vaginális stb.)

• A mukoadhézió komplex folyamatát különböző elmélet és mechanizmusok írják le, ezek kombinációja ad teljes képet, a különböző gyógyszerformák esetén különböző mechanizmusok dominálnak

• In vivo mukoadhéziós mérések helyett ex vivo kísérletek jellemzőek a korai fejlesztésben, nagy az érdeklődés az in vitro modellek irányában

• Jövő: in situ gélesedő, adhezív készítmények; összetett, de egyben jól repdukálható és az in vivo mérésekkel jól korreláló adhezív szubsztrátok

46/47

(47)

Köszönöm a figyelmet!

softmatter@mail.bme.hu

softmatters.bme.hu

_47/47