Ionok elválasztása: eltérő sebességgel haladnak át egy megfelelően megválasztott oszlopon

Ionkromatográfia

(IC: Ion Chromatography)

( g p y)

Ionok elválasztása: eltérő sebességgel haladnak át egy megfelelően megválasztott oszlopon

megválasztott oszlopon Ioncserélő gyanták

1971: „forced flow chromatography”:

N

₂

gáz +UV-Vis spektrofotometria: Fe(III) elválasztása

HPLC fejlődése megteremtette a műszeres hátteret az IC fejlesztéséhez hiányoztak a detektorok (klasszikus HPLC detektorok nem alkalmasak) hiányoztak a detektorok (klasszikus HPLC detektorok nem alkalmasak)

1975: vezetőképesség-mérésen alapuló detektálás: modern IC

elválasztásért felelős oszlop elválasztásért felelős oszlop szulfonált polisztirol-DVB

kicsiny ioncserekapacitás: 0,02 mmol/g y p , g elnyomó” oszlop

„elnyomó oszlop

nagy ioncserekapacitás

Ionkromatográf: g f Dionex Co.

Kationokra: spektrofotometriás meghatározások léteztek korábban is

Anionokra kicsiny koncentrációban (ppm) nem volt analitikai módszer

Ionkromatográfia

(IC: Ion Chromatography)

elválasztás: álló- és mozgófázis közötti ioncsere-egyensúlyon alapul szervetlen és szerves ionok elválasztására

Minta halmazállapota:

folyadék

¾nagyhatékonyságú analitikai módszer

¾kvalitatív & kvantitatív információk

¾összetett minták analízise

Mozgófázisa: folyadék Állófázisa: ioncserélő technikai kivitelezés: oszlop

¾összetett minták analízise

¾a mintát alkotó komponensek szétválasztása

technikai kivitelezés: oszlop (kiszorításos), elúciós analízis

Ionkromatográf felépítése: hasonló a HPLC-hez

Elúciós analízis

leggyakrabban alkalmazott technika

^jel

1. nem szorbeálódó eluens folyamatos átáramoltatása

2. minta bevitele B ^inte_g

3. elúció grális detek

A detektort elérő mintakomponens(ek) felgyülemlett mennyiségét méri.

Minta: A & B A

idő

ktorA

Minta: A & B

A: kevésbé kötődik

Analitikai információ:

idő

9minőségi: t (retenciós idő)

jel

dif

t_A t_B

•az állófázisra juttatott minta mennyisége igen kicsiny

9mennyiségi: csúcs területe

j y g g y fferenciális

„elhanyagolható” az eluenséhez képest

•nincs szükség regenerálásra

s detektor

Pillanatnyi különbséget mérnek az áthaladó eluens összetételében. idő

Állófázis:

•térhálósított műgyanta (pl: polisztirol-divinilbenzol kopolimer) vázon

i élő f k ió t k

ioncserélő funkciós csoportok

•módosított szilikagél

Ioncserélők:

•kationcserélők

Ioncserélők:

•erős

•kationcserélők

•anioncserélők

•erős

•gyenge

erős kation: SO H (szulfonsav) erős anion: kvaterner aminocsoport erős kation: -SO₃H (szulfonsav)

gyenge kation: -COOH

erős anion: kvaterner aminocsoport gyenge anion: primer aminocsoport

Kationcserélő:

n RSO₃H + Mⁿ⁺ (RSO₃)_nMⁿ⁺ + n H⁺ anioncserélő:

anioncserélő:

n RN(CH₃)₃OH + A^n- [RN(CH₃)₃]_nA + n OH^-

Ionok megkötődése függ:

¾méret

¾töltés

¾hőmérséklet

¾ionerősség

¾ionerősség

¾pH Állófázis:

pórusos gyanták: diffúzió: csúcs kiszélesedés

hatékonyság növelése: felületi porózus réteg: éles csúcsok (kicsiny minta kapacitás)y g p g ( y p ) Mozgófázis:

Kationok elválasztása: erős sav híg (vizes) oldata kompetíció a H⁺ (OH^-) Kationok elválasztása: erős sav híg (vizes) oldata

Anionok elválasztása: erős bázis híg (vizes) oldata Detektor: vezetőképesség mérés

p ( )

és a Mⁿ⁺ (A^n-) között az ioncserélő helyeken

p g

eluens: nagy a vezetőképessége: nagy háttérjel szupresszor oszlop: vezetőképesség „elnyomó”

Kationcserélő analitikai oszlop: nagykapacitású anioncserélő szupresszor Analízis:

n RSO₃H + Mⁿ⁺ (RSO₃)_nMⁿ⁺ + n H⁺

Kationcserélő: (KCl meghatározás acidi-alkalimetriásan)

3 ( SO₃)_n

Elnyomás: H⁺ semlegesítése (eluens + minta)

n RN(CH ) OH + A^n- + nH⁺ [RN(CH ) ] A + n H O n RN(CH₃)₃OH + A + nH [RN(CH₃)₃]_nA + n H₂O

A^n-: az eluens anionja

az eluens anionja megkötődik és vele ekvivalens mennyiségű az eluens anionja megkötődik és vele ekvivalens mennyiségű

hidroxidion kerül az oldatba

lecserélődik az analitikai oszlopon elválasztott kation ellenionja is:

lecserélődik az analitikai oszlopon elválasztott kation ellenionja is:

ekvivalens mennyiségű OH^- jut az oldatba

& kationok

vezetőképesség mérés eluens tároló pumpa adagoló analitikai kolonna

detektor PC ionelnyomó kolonna

ionelnyomásos IC

anionok elválasztása: kationcserélő szupresszor Szupresszor oszlop:

regenerálást igényel p

regenerálást igényel

csúcs kiszélesedét okoz – hatékonyság csökkenés Gyenge savak anionja nem meghatározhatók: y g j g

savas forma kicsiny vezetőképesség-változást eredményez

Kicsiny ioncserekapacitású oszlopok megjelenése: nem szupresszált rendszerek

TÖLTET E A TÖLTET A E

Anioncserélő:

TÖLTET-E^- + A^- TÖLTET-A^- + E^-

nem szupresszált rendszer (nincs szupresszor oszlop):

kicsiny vezetőképességű mozgófázis alkalmazása kicsiny vezetőképességű mozgófázis alkalmazása

eluens tároló pumpa adagoló analitikai kolonna eluens tároló pumpa adagoló

detektor PC egykolonnás (nem szupresszált) ICgy ( p )

Mozgófázis:

•benzoesav

•ftálsav

Detektor:

•vezetőképesség mérés

•UV-Vis ftálsav

•borkősav

•citromsav

UV Vis

1980’

Töltetek fejlődése: hatékonyság növekedés: folyamatosa növekvő számú alkalmazásj y g y töltettel szemben támasztott követelmények:

•lehető legnagyobb tányérszám

•töltet/eluens rendszer: gyors egyensúly (kinetikus csúcs kiszélesedés minimalizálása)töltet/eluens rendszer: gyors egyensúly (kinetikus csúcs kiszélesedés minimalizálása)

•retenciós idők: se túl nagy, se túl kicsi

•töltet/eluens rendszer: detektorral kapcsolható legyen

Az oszlop

Oszlop anyaga:

•saválló acél

•PEEK (poli(éter-éter-keton))

Oszlop méretei:

átmérő: 1-8 mm hossz: 3-30 cm Töltet:

PEEK (poli(éter éter keton))

polisztirol-DVB kopolimer módosított szilikagél

cellulóz alapúp szerves polimer-alapú töltetek:

kevésbé nyomástűrő (keresztkötések számával javítható)

duzzadnak: szerves oldószer csak kisebb koncentrációban alkalmazható duzzadnak: szerves oldószer csak kisebb koncentrációban alkalmazható pH stabilitás: 1< pH < 14

szilikagél: pH: 3-8

kicsiny (µm) szemcsék (HPLC) különböző méretű pórusok:

z g p

mikro & makro llik lá i öl pellikuláris töltet:

az állófázis porózus külső héjat alkot egy áthatolhatatlan szemcse felületén

Kationcserélő

HO₃S HO₃S

HO₃S SO₃H

ki i i k itá f lül ti ód ítá kicsiny ioncserekapacitás: felületi módosítás

Anioncserélő

CH₂N+⁺ R₃ CH₂N⁺ R₃

R₃⁺NCH₂ CH₂N⁺ R₃

ki i i k i á f lül i ód í á

kicsiny ioncserekapacitás: felületi módosítás

Módosított szilikagél OH

SiO

₂

OH

2

OH

OH

OH

H = A + B/u + C * u

A van Deemter egyenlet általános ábrázolása

H [mm]

C * u

H

_min

B/u

A u [cm/s]

szabálytalanabb töltet: nagyobb áramlási egyenlőtlenségek

u

szabálytalanabb töltet: nagyobb áramlási egyenlőtlenségek kisebb szemcseméret: kisebb egyenlőtlenségek

Mintaadagolás

1 a mintát pillanatszerűen kell bejuttatni az eluensbe 1. a mintát pillanatszerűen kell bejuttatni az eluensbe 2. keveredjen el az eluenssel (OLDHATÓSÁG)

minta térfogata: 10-50 µl (nincs térfogatváltozás)g µ ( g ) mikroliterfecskendő:

A bevitt minta térfogatát az adagolón elhelyezett hurok („loop”) térfogata határozza meg.

hatutas bemérő szelep hatutas bemérő szelep

alternáló mozgást végző, kis dugattyú-térfogatú pumpa

( i i )

(reciprocating pump)

térfogat: 10 100 µl

pulzálás: jelentősen csökkenthető: ikerfej alkalmazása (fáziseltolás) térfogat: 10-100 µl V

továbbított folyadék mennyisége: korlátlan áramlási sebesség változtatása:

lök t h

•löket hossz

•dugattyú sebessége ^idő

DETEKTOROK

Az eluenst alkotó ionok jelenlétében képesnek kell lennie, a minta ionjainak mérésére.

•csak a mintát alkotó komponensekre ad válaszjelet

•csak az eluenst alkotó komponensekre ad válaszjelet (indirekt detektálás)

•csak az eluenst alkotó komponensekre ad válaszjelet (indirekt detektálás) El ál tá i él ki bb d t kt j l

Eluens megválasztása: minél kisebb detektorjel

Detektorok

Kolonna: időben (térben) elválasztja az egyes alkotókat

Az adott komponens az eluenssel (vivőgázzal) együtt beáramlik a detektorba.

mennyiségi analízis: a detektor által előállított jel arányos az anyag koncentrációjával vagy időegység alatt bejutott mennyiségével koncentrációjával vagy időegység alatt bejutott mennyiségével

univerzális: minden molekulára ad jelet

szelektív: bizonyos vegyülettípusokra ad jelet

f k k bi l k l k d j l

specifikus: csak bizonyos molekulákra ad jelet destruktív

nem destruktív

dinamikus tartomány: az a koncentráció tartomány amelyben a koncentráció változása detektorjel változást eredményez

lineáris tartomány: T= mc (eltérés < 5 %)

érzékenység: m (egységnyi koncentrációváltozás hatására bekövetkező jelváltozás) kimutatási határ: az a koncentráció, melynek mérésénél a detektor válaszjele

egyértelműen megkülönböztethető a háttértől (LOD)

meghatározási határ: az a legkisebb koncentráció, amely megfelelő precizitással és pontossággal meghatározható (LOQ)

UV-Vis spektrofotométer

Alkalmazható: UV-Vis tartományban elnyel az adott komponens

Lambeert-Beer:

A

_λ

= ε

_λ

c l

„fényosztó”

(splitter)

mérő ág rés

(splitter)

D E T cella (küvetta)

I

₀

I

_{A = lg I}

0/I fényforrás

T E K f i á T

I

₀

I

₀

y

monokromátor

T O R referencia ág

Fényforrás:

UV: deutérium lámpa Detektor:

fotodióda

Cella:

kvarc küvetta l 5 10

Vis: volfrám lámpa l=5-10 mm

Diódasoros detektor DAD

(Dioda Array Detector)

polikromátor

fényforrás lencse cella (küvetta)

diód

diódasor

Előny:

különböző hullámhosszúságon mért elnyelések egyidejű mérése

spektrum felvétele: minőségi információ

Fluoreszcencia mérésen alapuló detektor

fluoreszkáló anyagok detektálása

é

monokromátor

cella (küvetta)

rés ( )

fényforrás

monokromátor

D k

Detektor:

a kibocsátott fényt méri pl. festékanyagok

pl. festékanyagok

Vezetőképesség mérésen alapuló detektor

V tőké é G [Si ] 1/R

Vezetőképesség: G [Siemens] 1/R

Ha egy elektrolit oldatba két azonos méretű, sík felületű, párhuzamos elektródlap (pl. Pt-gy , , p p (p lap) merül, amelyek felületének nagysága A, a köztük levő távolság pedig l, akkor az így kapott vezetőképességi cellára igaz, hogy

K=A/l: cellaállandó (geometria)

f jl ( ifik ) őké é dj ké é i (1 ²) f lül ű á ól

κ: fajlagos (specifikus) vezetőképesség: megadja a két, egységnyi (1 cm²) felületű, egymástól egységnyi távolságra (1 cm-re) levő elektród között levő elektrolitoldat vezetőképességét

ld k őké é ddi í l jd á

oldatok vezetőképessége: additív tulajdonság Függ:

¾ionok minőségétől (mozgékonyság)

¾i k á ától (k t á ió)

¾ionok számától (koncentráció)

Semleges molekulák: nem detektálhatók

El 2 l kt ód ( él) lh l á lá i lláb Elv: 2 elektród (acél) elhelyezve az áramlási cellában megfelelő feszültség: áram folyik

Áramerősség:

töltés méret koncentráció oldószer hőmérséklet töltés, méret, koncentráció, oldószer, hőmérséklet Egyenfeszültség: elektrolízis veszélye

Váltakozó feszültség: 100-10 kHz U= 20 V Váltakozó feszültség: 100 10 kHz, U 20 V

„Érintkezés mentes” cella

The detector works without direct contact of the

l t d ith th l t l Th i

electrode with the eluent or sample. The sensor is based on two metal tubes that are placed around a fused silica capillary with a detection gap of approximately 1.5 mm (Figure 4.2). The conductivitypp y ( g ) y sensor is based on two metal tubes that act as cylindrical capacitors. The electrodes may be placed around any nonconducting tubing such as fused

ili PEEK T fl D d l f th

silica, PEEK, or Teflon. Dead volume of the connecting tubing is minimized and an extremely low dead volume cell can be manufactured.

A high oscillating frequency of 40–100 kHz is

Detektor: vezetőképesség változása:

2 %/^oC g g q y

applied to one of the electrodes. A signal is produced on the other electrode as soon as an analyte zone with a different conductivity compared to the background

th h th d t ti A lifi d

zaj csökkentése

passes through the detection gap. An amplifier and rectifier are connected to the second electrode to measure resistance between the two electrodes. To isolate the two capacitors associated with eachp electrode, a thin piece of copper is placed between the electrodes and grounded.

Egyéb detektorok:

•potenciometria potenciometria

•amperometria

•atomabszorpció

•ICP

•tömegspektrometria

Termosztát: oszlop: ioncsere: hőmérséklet függés

eltérés a HPLC-től:

•Ionokat mérünk (HPLC is)

•Ioncserélő oszlopokat használ (HPLC is)

ALKALMAZÁSOK:

Klinikai

Gyógyszeripari

Élelmiszeripari

Környezetvédelmi

Ionpárkromatográfia:

C18 HPLC oszlop + mintát alkotó ionokkal ellentétes töltésű p ionok hozzáadása

HILIC fázis: Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography

CH

₃

SiO

₂

CH

₂

-N-CH

₂

-CH

₂

-CH

₂

-SO

₃

CH

CH

₃

+ -

CH

₃

Kapilláris elektroforézis

l k f é i l l ő kö b (ál láb í ) l k ő é

elektroforézis: valamely vezető közegben (általában víz) elektromos erőtér hatására a töltéssel rendelkező részecskék elmozdulnak

elektroforetikus elválasztás: az elválasztandó komponensek adott elektromos tér hatására kialakuló eltérő migrációs sebességén alapul

elektroozmotikus áramlás: (electroosmotic flow, EOF) a folyadék elektromos tér hatására valamely töltéssel bíró felület mentén kialakuló elmozdulása

κ = G K

^κ: fajlagos vezetőképesség [S cm^-1] G: vezetőképesség [S]

K: cellaállandó [cm[ ^-1]]

m

= κ

Λ

moláris fajlagos vezetőképességet (Λ_m)

m

c

Kohlrausch első törvénye

Λ = λ

++

+ λ

− λ+: a kation moláris fajlagos vezetőképessége [cm²Ω^-1mol^-1]

Λ

_m

λ λ

^λ : a kation moláris fajlagos vezetőképessége [cm Ω mol ] λ-: az anion moláris fajlagos vezetőképessége [cm²Ω^-1mol^-1]

Kohlrausch második törvénye: erős elektrolitok

2 / 1

0

kc

m

= Λ −

Λ

Λ₀: végtelen híg oldat moláris fajlagos vezetőképessége [cm²Ω^-1mol^-1] c: elektrolit koncentrációja [M]

k: állandó [M^-1/2]

ion vándorlását végtelen híg elektrolitoldatban

F l kt ő

F

_e

=z

_i

·e·E

^Fe: elektromos erő

z_i: az i komponens töltésszáma e: az elemi töltés

E: az elektromos térerősség [V·cm^-1] E: az elektromos térerősség [V·cm ¹] súrlódás miatt

F

_s

=k·η·v

_i⁰ k: állandó [cm]

η: az oldat viszkozitása [Pa·s]

v_i⁰: az i komponens vándorlási sebessége a végtelen híg oldatban Stokes-törvény: k=6πr

F F

⁰

^z

ⁱ

^{e E}

r_i az i ion hidrodinamikai sugara

A vándorlási sebesség egyenesen arányos a

F

_e

=F

_s

^E

v r

i

i

= 6 πη

i A vándorlási sebesség egyenesen arányos a térerősséggel.

E v

ⁱ

i

=

µ

mozgékonyság

i i i

r e z

µ πη

= 6

híg oldat, gömb alakú részecske

η

i

valóság: iont körülvevő ionok gátolják a mozgását (elektrosztatikus kölcsönhatások)

µ_i^eff: effektív elektroforetikus mozgékonyság q_eff: az ion effektív töltése

R: az ion teljes sugara

R q

_eff

eff

i

πη

µ = 6

R: az ion teljes sugara

η

az elektroforetikus mozgékonyság függ:

¾az ion töltésétől (lehet pozitív ill. negatív töltésének előjelétől függően)

¾az ion töltésétől (lehet pozitív ill. negatív töltésének előjelétől függően)

¾sugarától

¾alakjától

¾szolvatáltságának mértékétől

¾szolvatáltságának mértékétől

¾a közeg viszkozitásától

¾pH-jától,

¾i ő é től

¾ionerősségtől

¾hőmérséklettől

üveg felület & víz: szilanol csoportok

pH > 2 5: deprotonált forma: pozitív töltéseket vonzanak:

pH > 2,5: deprotonált forma: pozitív töltéseket vonzanak:

negatív elektród (katód) felé mozognak: folyamatos áramlás (dugószerű áramlási profil)

PC D

PC

E K E

D D

P P

V „inlet”

„outlet”

A kapilláris elektroforetikus készülék sematikus rajza

E: elektród; K: kapilláris; D: detektor P: puffertartó edény; PC: személyi E: elektród; K: kapilláris; D: detektor, P: puffertartó edény; PC: személyi

számítógép; V: tápegység

E L E

kation

E K T R

semleges

R O F

E

molekula

i

E R

O

anion

G R A

µ_a: látszólagos mozgékonyság Alapeset:

bemenet: + M

µ_e: effektív mozgékonyság

µ_EOF: elektroozmotikus áramlás

bemenet: + kimenet: - kation: komigrál

i k t i ál

µ

_a

= µ

_e

+ µ

_EOF anion: kontramigrál

D

katód (-) anód (+)

D

EOF v _k v _a

inlet outlet

V

V

k d ( ) d ( )

D

katód (-) anód (+)

EOF v _k v _a

inlet

outlet inlet

outlet

V

Fordított polaritás:

Fordított polaritás:

bemenet: - kimenet: +

követelmények:

A kapilláris

követelmények:

•kémiailag és elektromosan inert

•hajlékony j y kvarc kapilláris

•kellően szilárd

•megfizethető

kvarc kapilláris (poliimid bevonattal)

•ne nyeljen el az UV-Vis tartományban 25 µm - 100 µm

10 – 100 cm

bevonatos kapillárisok: polimerek, PVA, teflon

Kondícionálás: üvegfelület helyreállítása (NaOH)

A detektor

¾megfelelő érzékenység

¾kimutatási határ

¾kicsiny zajjal

¾nagy linearitási tartománnyal

¾gyors válaszidővel

¾gyors válaszidővel

Többféle mérési elv UV-Vis

fluoreszcencia f

vezetőképesség MS

UV-Vis: egyszerű, olcsó, széleskörben alkalmazható

UV-Vis

Lambert-Beer: A=εcl

háttérelektrolit eln elése

háttérelektrolit elnyelése

fényút hosszának növelése

fluoreszcencia

A tápegység

U=5-30 kV I 3 300 A I=3-300 µA

A feszültség változtatásának hatása:

növelve a kapillárisra kapcsolt feszültséget:

•nő a térerősségg

•nő az EOF

•csökkennek a migrációs idők célszerű nagyobb feszültségen dolgozni

•élesebb csúcsokat kapunk

növelve a kapillárisra kapcsolt fes ültséget:

növelve a kapillárisra kapcsolt feszültséget:

•nő az áramerősség

•egyre több hő egyre több hő szabadul fel (Joule hő) szabadul fel (Joule-hő) célszerű kisebb

•kiszélesednek a csúcsok

•csúsznak a migrációs idők

feszültségen dolgozni

I

U

Mintabevitel

hidrodinamikai injektálás:

nyomás alkalmazása

elektrokinetikus injektálás:

feszültség alkalmazása

elektroforetikus mozgékonyságtól

függ

pufferekkel szemben támasztott követelmények:

•nagy pufferkapacitás a kiválasztott pH-tartományban ki l lé d t ktálá h llá h á

•kis elnyelés a detektálás hullámhosszán

•kis mozgékonyság az áramtermelés minimalizálása érdekében

Pufferkoncentráció

C ökk té Nö lé

Csökkentése Növelése

↓ áram, Joule-hő termelődés ↑

↓ hőáramlás okozta zónaszélesedés ↑

↑ elektroozmotikus áramlás ↓

↓ meghatározás időtartama ↑

↑ adszorpció a kapilláris falán ↓

pH:

szilanolcsoportok protonáltsága (felületi töltésállapot) i t di iá iój

minta disszociációja

Áramlási profil

EOF lamináris áramlás

l h j j k ill i b l j b i d

áramlás hajtóereje a kapilláris belsejében mindenütt azonos

lamináris áramlási profilból eredő zónakiszélesedés a kapilláris

elektroforézisnél elhanyagolható

Szelektivitás:

Szelektivitás:

•puffer minősége, koncentrációja

•pH

Elő ök p

Előnyök

•rövid analízis idő

•nagy felbontóképesség (N: 10 nagy felbontóképesség (N: 10 -10 )

⁵

-10

⁶

)

•kicsiny oldószerfelhasználás

•egyszerű mintaelőkészítés gy

Há á k

Hátrányok:

•kisebb érzékenység

•kevésbé robusztus (reprodukálhatósági problémák) kevésbé robusztus (reprodukálhatósági problémák)

Á

ALKALMAZÁSOK:

bármi, ami befér a kapillárisba

Klinikai G ó

Gyógyszeripari Élelmiszeripari

Kö éd l i

Környezetvédelmi

Minőségi analízis

Alapja: a retenciós idő a minta komponenseinek minőségétől függ Alapja: a retenciós idő a minta komponenseinek minőségétől függ A legegyszerűbb módszer: a retenciós idők

(pontosabban a redukált retenciós idők)

relatív retenció (r_x,r): a kísérleti körülmények különbözőségéből származó (pontosabban a redukált retenciós idők)

összehasonlítása ismert vegyületek retenciós idejével

körülmények különbözőségéből származó eltéréseket kompenzálja

egy kiválasztott (r) anyagra vonatkoztatott redukált retenciós idő hányadosaként adnaky meg:

r t

x r

R_x '

=

' jel

x r

t

R_r ,

t_x idő ^jel

t_x idő t_r

Mennyiségi értékelés

a kromatogramon levő csúcsok területe (magassága) arányos a mintakomponensek a kromatogramon levő csúcsok területe (magassága) arányos a mintakomponensek

mennyiségével, ill. koncentrációjával.

Detektor: a komponensek vagy az eluens fizikai vagy kémiai tulajdonságainak Detektor: a komponensek vagy az eluens fizikai vagy kémiai tulajdonságainak mérése

1. kalibrációs módszer 2. addíciós módszer 3. belső standard módszer

A kalibrációs módszer

^jel

c₁ T₁ T = mc

T: csúcs területe

c: koncentráció (anyagmennyiség)

m: arányossági tényező (érzékenység) ^idő

j

T

jel

c₂ T₂ 1. független standard (kalibráló) oldatok

ismeretlen oldat: T T₃

ismeretlen oldat: T_x

T

jel

idő c₃ T₃ T₂

T_x

m

3 T₃

T₁

c

idő

c₁ c₂ c

3

c

x

Standard addíció

^jel _{cx T}

x

T_{1 x}=

idő j

T1,x_x+T₁

T₁=T_1,x-T_x T_{2 x}=

T

jel

c_x+ c₁ T_1,

x

T2,x_x+T₂

T₂=T_2,x-T_x

T₂

T₁ ^idő

jel c₂+ c T₂

T_x c₂ + c_x T_2,

x

c_x c₁ c

c

2

idő

Belső standard:

relatív terület meghatározásag a mintán belüli referencia

¾rögzített (meghatározott és állandó) koncentrációban (mennyiségben) a mintához

¾rögzített (meghatározott és állandó) koncentrációban (mennyiségben) a mintához hozzáadjuk a referencia anyagot

¾a referencia anyag csúcsára vonatkoztatjuk a meghatározni kívánt csúcsok területét Előnyök:

az analízis során fellépő hibák egy részét küszöböli ki:

d lá adagolás

érzékenység változása

Analitikai információ:

i ő é i t ió ( i á ió ) idő minőségi: retenciós (migrációs) idő retenciós (migrációs) idő függ:

alkalmazott körülmények:

alkalmazott körülmények:

•mozgófázis

•anyagi minőség

r = t

^'R_x

•áramlási sebesség

•állófázis

i ő é r

x r

t

R_r

,

=

'

•minőség

•hossz

•hőmérséklet hőmérséklet

•pH, ionerősség

•stb

minőségi információ: UV-Vis: spektrum

Növekvő igények: új detektorok alkalmazása, fejlesztése

Tömegspektrométer

Tömegspektrometria (MS) Nobel-díj:

1922 1989 2002

Alapelve:

a gázállapotú ionizált molekulákat ezek töredékeit (un fragmenseit)

1922, 1989, 2002

Alapelve:

a gázállapotú ionizált molekulákat, ezek töredékeit (un. fragmenseit) vagy bizonyos esetekben az atomokból képződött ionokat tömegük alapján szétválasztja, majd mennyiségileg meghatározza

1. mintabevitel és a minta gázállapotba hozása 2. ionizáció és bizonyos esetekben fragmentáció

3 a keletkezett ionok töltésegységre jutó tömegük szerinti elválasztása 3. a keletkezett ionok töltésegységre jutó tömegük szerinti elválasztása 4. a szétválasztott, különböző tömegű ionok mennyiségének meghatározása

A készülék felépítése:

A készülék felépítése:

vezérlő- és adatfeldolgozó rendszer

mintabevitel ionforrás analizátor detektor

vákuumrendszer

A vákuumrendszer

1 i f á b f l lő h ék á l lő állí h ók l k i k

1. az ionforrásban megfelelő hatékonysággal elő állíthatók legyenek az ionok 2. megfelelő hosszúságú szabad úthosszat kell biztosítani:

az ionforrásban képződött ionok ütközés nélkül eljuthassanak a detektorba az ionforrásban képződött ionok ütközés nélkül eljuthassanak a detektorba

kb. 10^-3 Pa kétlépcsős nyomáscsökkentés:

1. elővákuum: néhány torr 2. nagyvákuum: 10^-3 Pa vákuumszivattyú:

2. nagyvákuum: 10 Pa

1. atmoszférikus nyomásról képes közvetlenül gázt elszívni (rotációs szivattyúk) 2. működéséhez un. elővákuum megteremtése szükséges (diffúziós szivattyúk)

Olajrotációs pumpa

Olajrotációs pumpa

előnye:

kicsiny háttérzaj

Előny:

Ki i l k l tö ű l ( l H )

Kicsiny molekula tömegű eluens (pl. H

₂

)

is hatékonyan eltávolítható

Ionizációs módszerek Ionizációs módszerek

lehetővé teszik a különféle halmazállapotú, igen eltérő tulajdonságokkal bíró anyagféleségek ionizációját

Elektronionizáció (electron impact ionization, EI) legáltalánosabban alkalmazott ionizációs technika

EI

1: mintabevezető nyílás; 2: ionvisszaverő lemez (repeller); 3: izzószál; 4:

elektronbevezető nyílás; 5 és 6: iongyorsító rés; 7: belépő nyílás; 8: ionképződés helye; 9: anódy

∆U=5-100 V

T≈ 200 ^oC

EI

p ≈ 10^-8-10^-9 atm p ≈ 10 10 atm elektronok U

energia molekula energia

gerjesztett molekula

elektron emisszió

molekulaion fragmens ionokg

fragmentáció: elektronok energiája (gyorsító feszültség: 70 eV) minőségi azonosítás (ujjlenyomat)

minőségi azonosítás (ujjlenyomat)

általában : egyszeres pozitív ionok képződnek általában : egyszeres pozitív ionok képződnek

negatív ionok: nagy elektronegativitású atomok vannak jelen a molekulában

Kémiai ionizáció (CI)

a mintát az elektronforrásba történő belépése előtt un. „reagens” gázzal hígítják a mintát az elektronforrásba történő belépése előtt un. „reagens gázzal hígítják nem a vizsgálandó minta lép közvetlen kölcsönhatásba az elektronokkal, hanem a

hígító gáz molekulái mintát alkotó komponensek: szekunder ionizáció RH e^- RH⁺

RH RH⁺

RH⁺ + M MH⁺ + R protontranszfer primer-ion képződés

CH₄ + e^– = CH₄⁺ + 2e^– (CH₃⁺) k d i ké ődé

a) proton transzfer CH₅⁺ + MH = CH₄ + MH₂⁺ szekunder-ion képződés

CH₄⁺ + CH₄ = CH₅⁺ + CH₃ (CH₃⁺ + CH₄ = C₂H₅⁺ + H₂)

b) hidrogén absztrakció CH₃⁺ + MH = CH₄ + M⁺ (C H ⁺ MH C H M⁺) (C₂H₅⁺ + MH = C₂H₆ + M⁺)

c) töltésátvitel)

CH₄⁺ + MH = CH₄ + MH⁺

Kémiai ionizáció (CI)

R á

Reagens gáz:

•metán

•i-bután

•ammónia

Ionizáció: a hígító gáz minőségétől függően [M+H]⁺, [M-H]^-, [M+NH₄]⁺

Előnyök:

•egyszerűsíti a tömegspektrumot

•molekulaion tömegét adja meg

•molekulaion tömegét adja meg

Atmoszférikus nyomású ionizációs technikák

(atmoszférikus nyomáson működnek) minta T elpárologtatás

ionizálás kapcsolt technikák: HPLC-MS

•termikus ionizáció

•elektromos tér okozta ionizációelektromos tér okozta ionizáció

•ionütközés okozta ionizáció

•gyors atom ütközési

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)

MINTA + mátrix (ionizációt segíti)

grid

( )

hν laser

Gas phase ions

g

a T

⁺ ₊ ⁺

+ +

+ +

g r e

“Time-of fligth”

+ tube

+

+ ++

+ +

+ +

+

e t

+ + +

+

+ + +

+ +

U

_acc

source

Analizátorok

az ionok tömeg/töltés szerinti elválasztása Jellemzése:

Jellemzése:

1. maximális tömegszám: amelynek vizsgálatára még alkalmas az adott analizátor 2. transzmisszió: a detektort elérő és az ionforrásban keletkezett ionok hányadosa

3 f lb tá li át kk tö külö b é l t d l ál t i két i t 3. felbontás: az analizátor mekkora tömegkülönbséggel tud elválasztani két iont

•szektor típusú

•kvadrupól

•kvadrupól

•ioncsapdás

•repülési idő analizátor

Szektor típusú analizátorok

Ionok elválasztása:

mágnes Ionok elválasztása:

Mágneses tér vagy a gyorsító feszültség változtatása

E= qU=zeU ½ mv² = zeU mágnes

ionnyaláb E_kin= ½ mv²

q z ½ mv² = zeU v = m

zeU 2

á

m

ionforrás detektor

Lorentz-erő

mv²/r= zevB F_L = zevB

F_c = mv²/r F_L= F_c

zevB mv

²

r =

r = mv/(zeB) = (m/z) (v/eB)

Elektrosztatikus analizátor

egyszeres fókuszálás: felbontása korlátozott

kétszeres fókuszálás: mágneses + elektromos fókuszálás: jobb felbontás kétszeres fókuszálás: mágneses + elektromos fókuszálás: jobb felbontás

Kvadrupólus analizátorok

olcsó, egyszerűen kezelhető, stabilis, reprodukálható tömegspektrumot eredményező analizátor

1: ionizáló elektronsugár; 2: az analizátor által kiszűrt ionok útja 1: ionizáló elektronsugár; 2: az analizátor által kiszűrt ionok útja

3: az analizátor által átengedett ionok útja; 4: detektor

egymással szemben elhelyezkedő rudakat elektromosan összekötve azokra egyen- és váltóáramot kapcsolva kvadrupoláris változó elektromos tér alakul ki

az ionok oszcilláló mozgást végezve haladnak átg g oszcilláció amplitúdója függ:

•ion töltése

•ion tömege

•alkalmazott feszültségek Ioncsapdás analizátor: (IonTrap) módosított kvadrupólus analizátor

„tárolni tudja az ionokat”

Repülési idő analizátorok

azonos kinetikus energiájú ionok sebessége vákuumban, külső elektromos vagy

ionforrás U Ionok repülési cső

mágneses teret nem tartalmazó közegben, tömegük négyzetgyökével fordítva arányos ionforrás

(egyenlő mozgási energia) (tér mentes)

U

Kisebb tömegű ion: nagyobb sebesség

2

v = ^{2 zeU} _m

Tandem MS MS/MS

Q/Q/Q (TRIPPLE QUAD) Q/TOF

TOF/TOF

Tandem

„in space”: QQQ, QTOF TOF/TOF

szerkezetvizsgálat

„in time”: IT

MS

ⁿ

minőségi azonosítás

Detektorok

az analizátor által elválasztott, adott idő alatt becsapódott ionok számát határozza meg pontdetektor: az ionok egymást követően érik el a detektor ugyanazon pontját Csak olyan analizátorral alkalmazható együtt, amely képes az ionokat időben

elválasztani egymástól: pl. kvadrupólus Elektronsokszorozó:

1. a fókuszált ionnyaláb egy un. konverziós dinódába ütközve onnan elektronokat lök ki

lök ki

2. kilökődött elektronokat megfelelő feszültséggel gyorsítjuk

3. újabb és újabb felülettel ütköztetve megsokszorozott elektronáramot kapunk fotokonverziós detektorok: a becsapódó ionok hatására kilökődött elektronokat

szcintillátor segítségével fotonokká alakítjuk, majd a kibocsátott fotonokat f t l kt k ó l l kt j llé l kítj k

fotoelektronsokszorozóval elektromos jellé alakítjuk

jobb hatásfok, hosszabb élettartam és kisebb karbantartási igény

Sordetektor: egymástól térben elválasztott ionok egyidőben érik el a kilépőrésnél Sordetektor: egymástól térben elválasztott ionok egyidőben érik el a kilépőrésnél elhelyezett detektor sort

drága: magasabb árfekvésű készülékekben alkalmazzák (TOF szektor) drága: magasabb árfekvésű készülékekben alkalmazzák (TOF, szektor)

Kapcsolt technikák

A t é bí h tó i ő é i é i é i lí i lké lh t tl i tát valós minták: komplex, sokkomponensű rendszerek

A pontos és megbízható minőségi és mennyiségi analízis elképzelhetetlen a mintát alkotó komponensek elválasztása nélkül.

elválasztástechnikai eljárás alkalmazása szükséges elválasztástechnikai eljárás alkalmazása szükséges

A hagyományos kromatográfiás technikák azonban még tökéletes szeparáció

é kí ál k b lú bi á i ő é i í á

esetén sem kínálnak abszolút biztonságos minőségi azonosítást.

minőségi információ: csak az adott komponens retenciós viselkedése a manapság megkövetelt megbízható és reprodukálható meghatározások

indokolják a tömegspektrometria és az elválasztástechnikai módszerek kombinálását

A következő feltételeknek kell teljesülnie ahhoz, hogy a két, meglehetősen eltérő

kö ül é k kö ö űködő ód k l i dj k á h

körülmények között működő módszert kapcsolni tudjuk egymáshoz:

•A kombináció ne vezessen kromatográfiás hatékonyság csökkenéshez.

•A kromatográfból a tömegspektrométerbe történő bevezetés során a minta alkotóiban nem kontrollált kémiai átalakulás ne menjen végbe

alkotóiban nem kontrollált kémiai átalakulás ne menjen végbe.

•A minta megfelelő mennyisége bejusson és ionizálódjon a tömegspektrométerben.

•A kromatográfot és az MS-t összekapcsoló un. interfész ne növelje számottevően a hátté jt

háttérzajt.

•Az interfész legyen egyszerű felépítésű, könnyen használható, tisztítható és karbantartható valamint lehetőség szerint olcsó.

•Az interfész legyen kompatibilis valamennyi kromatográfiás körülménnyel (pl.

vivőgázok, oldószerek, áramlási sebesség, pH, hőmérséklet, stb.).

•Az interfész ne korlátozza az MS nyújtotta lehetőségeket (pl. ionizáció, vákuum, y j g (p felbontóképesség, stb.).

•Az interfész alkalmazásával nyert eredmények reprodukálhatók legyenek.

Atmoszférikus nyomású ionizációs technikák HPLCMS

N b l díj

ESI (ElectroSpray Ionization)

Nobel-díj

ESI

az oldatbeli ionok gázfázisba juttatása

ION EVAPORATION COULOMB FISSION

APCI

(Atmospheric Pressure Chemical Ionization) nem szükséges ionok jelenléte az oldatban

elektromos kisülés: szekunder ionizáció elektromos kisülés: szekunder ionizáció

CEMS

Interface:

GCMS

•jet-szeparátorj p

•membrán alkalmazása

kicsiny átmérőjű (d ≤ 0,25 mm) kapilláris oszlopok elterjedése:

i t f élküli kö tl tl k t tá interface nélküli, közvetlen csatlakoztatás

EI 1. anyamolekula gerjesztődik

2. ionizálódik 3. fragmentáció

fragmentáció:

•kötéshasadás

•a molekulát alkotó atomok átrendeződése f g

tömegspektrum: m/z függvényében ábrázolt beütésszám molcsúcs: molekulaion csúcsa

báziscsúcs: legintenzívebb vonal

leányion: molekulaionból képződő ion unokaion: leányionokból képződő ion

relatív intenzitás

CH

₄

m/z = 16 I 100 m/z = 15

I_r = 100 I_r ≈ 95

m/z = 14

m/z = 17 I 1 1 I_r ≈ 20

I_r = 1,1

m/z

Fontosabb elemek izotópeloszlása

Elem % Elem % Elem %

1H 99,985, ¹⁶O 99,76, ⁷⁹Br 50,69,

2H 0,015 ¹⁷O 0,037 ⁸¹Br 49,31

10B 20 ¹⁸O 0,204

11BB 8080 ³²SS 95 0095,00

12C 98,892 ³³S 0,76

13C 1,108 ³⁴S 4,22

14N 99 63 ³⁵Cl 75 77

14N 99,63 ³⁵Cl 75,77

15N 0,37 ³⁷Cl 24,23

A elem: F, P, I

A+1 elem: C, N, B

A+2 elem: Cl Br S O

A+2 elem: Cl, Br, S, O

A C elméleti spektruma ^A+1

12.00

A C elméleti spektruma

0.8 0.9

0.5 0.6 0.7

dance

0.3 0.4 0.5

Abund

0.1 0.2

13.00

10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0

m/z 0.0

A C elméleti spektruma A C ₁₀ elméleti spektruma

120.00

0.7 0.8

10 1 1% 11%

0.5 0.6

ance

10 x 1,1% = 11%

0.3

Abunda0.4

0.1 0.2

121.00

122 00 123 01 124 01 125 01 126 02 127 02 128 02 129 03

118 120 122 124 126 128 130 132

m/z

0.0 122.00 123.01 124.01 125.01 126.02 127.02 128.02 129.03

A C elméleti spektruma A C ₁₀₀ elméleti spektruma

1201.00

0.30

0.35 1200.00

0.20 0.25

dance

1202.00

0.10

Abund0.15

0.05

0.10 1203.01

1204.01

1206 02 1208 02 1210 03 1212 04 1215 05 1217 05 1219 06 1221 07

1200 1205 1210 1215 1220

m/z

0.00 1206.02 1208.02 1210.03 1212.04 1215.05 1217.05 1219.06 1221.07

A C elméleti spektruma A C ₁₀₀₀ elméleti spektruma

0.12 12011.03

12012.04 12009 03

0.09 0.10

0.11 12009.03 12012.04

12013.04 12008.02

0.06 0.07 0.08

undance

12014.04 12007.02

12015.05

0.03 0.04

Abu0.05

12006.02

12016.05 12017 05 12005 01

0.00 0.01 0.02

12017.05 12005.01

12018.06

12004.01 12019.06

12021.07 12027.09 12032.10 12038.12 12044.14 12049.16

12000 12010 12020 12030 12040 12050

m/z

Br 1 Br: 2 csúcs : 50-50%

A+2 Br

0.45 0.50

78.92

80.91

0.35 0.40

0 20 0.25 0.30

Abundance

0.10 0.15 0.20

77 78 79 80 81 82

0.00 0.05

m/z

2Br 2Br

2 Br: 3 csúcs : 25-50-25%

159.83

0 35 0.40 0.45

0.25 0.30 0.35

undance

157.84

161.83

0.15

Abu0.20

0.00 0.05 0.10

156 157 158 159 160 161 162 163

m/z

3Br 3Br

3 Br: 4 csúcs : 12,5-37,5-37,5-12,5%

238.75

240.75

, , , ,

0.30 0.35

0.20 0.25

dance

0 10

Abund0.15

236.76

242.75

0.05 0.10

235 236 237 238 239 240 241 242 243 244

m/z 0.00