integrális detektordifferenciális detektor

Folyadékkromatográfiás állófázisok

Kromatográfia:

kvázi-egyensúlyon alapuló elválasztási módszerek álló- és mozgófázis között eltérı megoszlás

eltérı vándorlási sebesség: ELVÁLASZTÁS elválasztást befolyásolja:

minden, ami megváltoztatja a vándorlási sebességet álló- és mozgófázisban bekövetkezı változások

Klasszikus felosztás:

•normál fázisú (NP) LC

•fordított fázisú (RP) LC

•ioncserés

•méretkizárásos

Szilikagél alapú állófázisok és jellemzésük

HPLC-ben alkalmazásuk 80-90% (M_w< 10000)

a porózus szilikagél termodinamikailag nem stabil ⇒ stabilis egyensúlyi szerkezet: a kristályos kvarc

eltérı módon elıállított és utókezelt szilikagélek ⇒ messze az egyensúlyi állapottól ⇒ kromatográfiás tulajdonságok eltérıek

Az –Si – O – Si- kötés kevésbé polarizált, felületen –OH (szilanol) csoportok állnak a mozgófázis felé

Szilikagél állófázisok felületi sajátságai:

a szilikagél felülete energetikailag inhomogén

fémionok beépülése: erıs komplexképzı és ioncserélı centrumok harmadik generációs szilikagél: ppm-nyi fémszennyezés

szilanolcsoportok helyzete

OH Si O

OH Si

O O O

O Si

O Si

H H

H H

O Si O

O Si O H H izolált (szabad) H-hidas (vicinális) dezaktivált O

OH Si

HO diol

HPLC-ben használt szilikagélek jellemzése

•Alak, geometria: gömb, szabálytalan

•Átlagos szemcseátmérı, d_p, 3-10 µm

•Szemcseméret eloszlás: ±20%

•Pórusátmérı: 6-30 nm (60 – 300 Å)

•Fajlagos felület: A_s, 50- 400 m²/g

•Fajlagos pórus térfogat: 0,5 -1,0 cm³/g

Gömb és szabálytalan alakú szemcsék

Szabálytalan alakú szemcsék porlódása

szabályos szemcsék:

•ellenállnak a nyomásterhelésnek

•kevésbé porlódnak

•térkitöltésük egyenletes

Szemcseátmér ı

Szők szemcseátmérı eloszlás fontossága:

•Kisebb szemcsék beékelıdnek a nagyok közé (beton effektus), eltömik a kolonnát

•Jelentısen nı a zónaszélesedés, ha nı a szemcseméret eloszlás szabálytalanabb töltet: nagyobb áramlási egyenlıtlenségek

kisebb szemcseméret: kisebb egyenlıtlenségek

Átlagos pórusátmér ı : d

_p

d_p < 2 nm (20 Å) ⇒ mikropórus 2 < d_p < 50 ⇒ mezopórus d_p > 50 nm (500 Å) ⇒ makropórus

hagyományos töltetek: az anyag diffúzióval jut be a pórusokba kis átmérı: gátolt diffúzió:

kiszélesedés

Nemcsak a pórusátmérı (d_p) a pórusok alakja is eltérı:

legjobb az átmenı pórusú szilikagél

d_p[nm]

gyakoriság [%]

d_p

d_p[nm]

gyakoriság [%]

Pórusátmérı eloszlás:

• normális eloszlás: Gauss-görbe maximuma

• kettıs vagy szabálytalan eloszlás

Átmen ı pórusú szilikagél

gyorsabb anyagátmenet az álló és a mozgófázis között:

zónaszélesedés kisebb

pórusátmérı>>molekula geometriai átmérıje

Fajlagos felület: A

_s

Szemcse belsı és külsı felülete együtt határozza meg!

ha gömb: 10

µ

^{m és d}_p ^{= 10 nm ⇒külsı} felület: 0,3 m²/g

⇒belsı felület: 200-300 m²/g A fajlagos felületet (A_s) a belsı felület szabja meg!

A szemcseátmérı változásával (ırlés) a fajlagos felületet nem változik számottevıen!

A pórusátmérı változása a belsı felület és ezáltal a fajlagos felület változását okozza: hıkezelés (kalcinálás) hatása!

Nagy fajlagos felület: A_s = 500-1000 m²/g (mikropórusok jelenléte)

megszabja a molekula tartózkodási valószínőségét az állófázison:

RETENCIÓ

Fajlagos felület mérés

N₂ adszorpciója: BET izoterma

N₂ kis molekula, a mikropórusokba is behatol, a teljes fizikai felületet megadja

BET izoterma alapján azonos fajlagos felület nem minden esetben jelent azonos retenciót. Csak akkor, ha: a pórusszerkezet és ezen belül a póruseloszlás is egyezı

Fajlagos pórustérfogat: V

_p

Pórustérfogat (V_p): az a folyadék térfogat, amellyel a pórusok a pórusfalat nedvesítı folyadékkal feltölthetık. (Közvetlenül mérhetı.)

( ) ^{bar p 14,708} ( ) ^µm

p

w

≈

_{ahol pw}: átlagos pórusátmérı azonos szemcseátmérı, különbözı:

•pórusátmérı

•fajlagos felület

•pórustérfogat

porozitás mérés mikropórusok esetén: higanyos porozitás mérı Washburn: az a nyomás, mely ahhoz szükséges, hogy a higanyt a pórusokba préseljük:

porozitás:

szemcse p

p

V

= V ε

Minél kisebb a pórusátmérı, annál nagyobb Hg nyomás szükséges a pórusokba hatoláshoz. Felvilágosítást ad a póruseloszlásról is

Higanynyomás változása a porozitás vizsgálatokban

1. Pórusátmérı szők tartományú

2. Eltérı pórusátmérıjő töltet

A mikropórusok jelenléte (anyagátadási gát) ⇒ csúcsszélesedés 1

2

p

d

_p

Szilikagél el ı állítása

A szilikagél porozitása és felületi tulajdonságai nagyban függnek az

elıállítás módjától!

háromdimenziós aggregátum: porózus szerkezet létrejötte

sziloxán kötések: hidrogél stabilitása nı

víz eltávozik, újabb sziloxán kötések, térfogatcsökkenés, gél stabilitása nı

mikropórusok mezopórusokká alakítása:

hı vagy vízgız kezelés

Hidrolízis

Na₂SiO₄; SiCl₄; Si(OR)₄

pH, T, só

Szilika szol stabilizálás

lúg, só

Szol-gél átalakítás

pH, só, T

Utóérlelés

pH

gömb alak, nemporózus A_s: 50-400 m²/g

Szárítás, hevítés

T (t)

Hidrotermikus utókezelés

T

Mosás

Szol-gél átalakulás: porózus szerkezet kialakulása

HO

OH OH

OH OH OH

HO HO

HO

OH OH

OH OH OH

HO HO

HO

OH OH

OH OH OH

HO HO

HO

OH OH OH HO

HO

5-100 nm

HO HO

HO

OH OH

O OH

HO HO

O

OH OH OH OH

HO

OH OH

OH OH O

HO HO

HO

OH OH OH OH

HO HO

n db Nem pórus

Pórus

HO

Kromatográfiás min ı ség ő szilikagél el ı állítása

Hasonló pórusszerkezető és „szennyezettségő” szilikagél elıállítása

Szilika szolt nem vizes közegen engedik át: kis átmérıjő cseppek képzıdnek ⇒ hidrogéllé alakulnak

Szilikahidrogélt szárítják ⇒ végsı pórusszerkezet 673-1073 K-en hevítik (kalcinálják)

Két paraméter befolyásolja a pórusszerkezetet:

• Szilika szol NaOH tartalma: nehéz kimosni (ez okozza a vizes zagy lúgos pH-ját)

• Kalcinálás hımérséklete

Nincs két egyforma szilikagél, legfeljebb azonos gyártó esetén!

Különbözı pórusmérető Lichrosorb szilikagélek adatai

A pórusméret csökkenésével nı a fajlagos felület, de jelentısen csökken az ún. kizárási tömeg: a molekula nagyobb, mint a

pórusátmérı, nem fér be a pórusba

40000 1,0

300 Si 100

20000 0,7

500 Si 60

4000 0,6

800 Si 40

Kizárási

molekulatömeg [dalton]

Fajlagos pórustérfogat

[ml/g]

Fajlagos felület [m²/g]

Pórusátmérı [Å]

Alumínium-oxid alapú kolonnák

Lúgosan kezelt ill. közel semleges Felület függ:

•a kezelés pH-jától

•a kezelés hımérsékletétıl

fajlagos felülete kisebb: 50-200 m²/g gyengébb adszorpciós kölcsönhatások

Az alumínium-oxid pórusai inkább téglatest alakúak, mint hengeresek: alakszelektív elválasztás

Snyder: az oldószererısség kb. 10%-kal kisebb

0

oxid alumínium

1,1ε 0

szilikagél

ε ≈ −

Vízre érzékeny: felületi –OH csoportok Hasznosítás: - savérzékeny vegyületek

- alakszelektív elválasztás

Poláris(abb) állófázison apoláris(abb) mozgófázissal (közepesen) poláris vegyületeket választunk el.

Zwett: klorofillokat választott el krétaporon petroléter segítségével

állófázisokkal szemben támasztott követelmények:

•mechanikai stabilitás

•kis szemcseátmérı, szők szemcseméret-eloszlás

•energetikai homogenitás: visszatartásért felelıs helyek hasonló kölcsönhatási energiával rendelkeznek

•ismert pórusátmérı, pórusalak, pórusméret-eloszlás

Normál fázisú kromatográfia

szilikagél:

•kémiai inertség

•jó mechanikai ellenállóképesség (1000 bar)

•pH stabilitás: 2 < pH < 7 (9)

normál fázisú kromatográfia állófázisai:

•szilikagél (80-90%)

•szilikagélhez kémiailag kötött poláris csoportot tartalmazó fázisok (bonded phase): amino, ciano, diol, nitro stb. (5-10%)

•alumínium-oxid (5-10%)

Kémiailag módosított poláris adszorbensek

a fejlesztés oka:

•víz okozta dezaktiváló hatás csökkentése

•szelektivitás növelése

•a kölcsönhatás csökkentése

•energetikailag homogénebb felület kialakítása

Ha az eluens nem tartalmaz vizet, a víz jelentısen befolyásolja a felületet: a legnagyobb energiájú adszorpciós helyeken kötıdik meg:

retenció csökkenése Aktiválás

•mosás egyre apolárisabb oldószerrel: alkohol-éter-kloroform-hexán

•aktiválás 150-200 °C-on, N₂ áramban

víz okozta dezaktiváló hatás

Legelterjedtebb: -Si-O-Si- kötéső módosított fázisok

árnyékoló csoport: távol tartja a mintát a felülettıl szilanolcsoportok hatásának csökkentése

távtartó csoport: aktív csoport eltávolítása a szilikagél felületétıl

Szilanolcsoportok maximum 60%-a alakítható át.

Si - ^{O Si CH}

2

-CH

₂

-CH

₂

-NH

₂

CH

₃

CH

₃ ^árnyékoló

távtartó (spacer)

kölcsönható

leggyakoribb módosítók:

•amino (NH₂)

•ciano (CN)

•diol (OH)

fordított fázisban is alkalmazhatóak

Fordított fázisú kromatográfia

A mozgófázis polárisabb az állófázisnál

fordított fázisú állófázisokkal szemben támasztott követelmények:

• mechanikai stabilitás

• energetikai homogenitás: visszatartásért felelıs helyek hasonló kölcsönhatási energiával rendelkeznek

• jó pórusszerkezet

• apoláris felület

leggyakrabban alkalmazott állófázis (hordozó):

Szilikagél

alkalmazható pH tartomány:

Felsı határ: szilikagél oldhatósága

(pH: 8-9, utószilanizálással növelhetı) Alsó határ: módosító csoportok hidrolízise

(pH: 1-2, fém szennyezık jelenléte gyorsítja)

HPLC fordított fázisok csoportosítása:

1. Monomer módosítású fázis 2. Átmeneti módosítású fázis 3. Polimer módosítású fázis

1. Monomer fázisok

monofunkciós klór-szilánokkal történı felületmódosítás

A reakció után 50-60% szabad szilanolcsoport marad a –CH₃ csoportok árnyékolása miatt (teljesen borított felület nincs)

Si-OH + Cl Si R CH₃

CH₃

Si-O Si R CH₃

CH₃

+ HCl

Szabad szilanolcsoportok hozzáférhetısége függ:

• pórusszerkezettıl: a reakció hatására a pórusokban létrejött réteg szőkíti a pórusokat

• mozgófázis összetételétıl:

-nagy víz tartalmú eluens: az alkillánc (pl. C₁₈) a felületre „borul”, elfedi a szabad szilanolcsoportokat

-nagy szerves oldószer tartalmú eluens: C₁₈ láncok kinyílnak,

„lobognak”, szabad szilanolok hozzáférhetıvé válnak a mintakomponensekre. Megoldás: árnyékolás ⇒ szilanizálószer nagyobb, pl. 2-propil-csoportot tartalmaz (metilcsoportnál

„magasabb” sztérikus gát)

MeOH

felületre „borulva” „lobognak”

A fordított fázisú töltet jellemezhetı a hidrofób/hidrofil felület arányával

Hidrofób felület (C₁₈): gyenge diszperziós kölcsönhatás (4-20 kJ/mol) Hidrofil felület (-OH): erıs H-hidak (50-80 kJ/mol)

A felületen lévı fémionok befolyásolják a szilanolcsoportok disszociációját (pK_a változik ±1 egységgel)

szilikagélek fémion tartalma:

•elsı generációs: 150-200 ppm

•második generációs: 10-100 ppm

•harmadik generációs: <1 ppm

Hidrofób/hidrofil felület arány, fémion tartalom miatt kontrollálatlan fázisok: egy gyártón belül sincs két azonos fázis

2. Átmeneti módosítású fázisok

Bifunkciós klór-szilánok alkalmazása: 1 lépésben 2 szilanolcsoport módosítása

Víz jelenlétében: ≡Si-Cl kötés hidrolizál ⇒ -OH

A reakciókörülmények (pl. víztartalom) állandó értéken tartása elengedhetetlen a reprodukálható állófázis elıállításában.

Si

Cl

Si

OH CH₃

R

Cl +

-2HCl

OH

OH

Si

Si

O CH₃

O R

OH

2. Átmeneti módosítású fázisok

Si

Cl Si OH

CH₃ R

Cl +

-HCl

OH

OH

+H₂O

Si

Si OH

CH₃ + Cl

O

OH

-HCl

R

+H₂O

-HCl Si

Si OH

CH₃ + OH

O

OH

+szililezıszer -HCl

Si

Si OH

CH₃ + O

O

OH

Si

CH₃ Cl

R

R R

Hidrofób/hidrofil felületarány változtatható

Monomer módosításhoz képest: eltérı sajátságú állófázis

3. „Polimer” módosítású fázisok

Trifunkciós klór-szilánok alkalmazása víz tartalmú oldószerben:

felületi térhálós polimer

Reaktáns: triklór- vagy trietoxiklór-szilán + víz

Maximum két –Cl reagálhat a szilanolcsoportokkal

Harmadik –Cl további reakció ⇒ a felületen térhálós polimer jön létre

Si

Cl

Si

OH Cl

R

Cl +

-2HCl

OH

OH

1.

Si

Si

O Cl

O

OH Reakcióképes

csoport

R

Si

Cl OH Si

Cl + Cl

-2HCl

OH

OH Reakcióképes

csoport

R Si

Cl

O Si

Cl OH

OH

R

Reakcióképes csoport

+H₂O és szililezıszerre térhálósódás

+H₂O és szililezıszerre térhálósódás

2.

+2H₂O

-2HCl Si

Si OH

R + OH

O

OH

+szililezıszer -HCl

Si

Si OH

R + O

O

OH

Si Cl Cl OH

R

3.

O

POLIMERIZÁCIÓ

polimer módosítású állófázis:

hozzáférhetı és leárnyékolt szilanolcsoportok polimerizáció: az oldatfázisban is lejátszódhat

állófázis tulajdonságai: polimer szerkezetétıl függenek

Utószilanizálási reakciók

A maradék szabad szilanolcsoportok utólagos eltüntetése:

„End capping”

Módszerei:

1. Reagens: kellıen kis mérető, hogy a zegzugos polimerbe beférjen

⇒ trimetil-klór-szilán

Jó a polimer –OH-ra, kevésbé hatásos a szilikagél felületén lévı – OH-ra

2. Kétszeres utószilanizálás: a hosszú módosító láncok közül a könnyen hidrolizálhatót rövidebbre cserélik (nı a stabilitás)

szabad szilanolcsoportok: nemkívánatos kölcsönhatások (csúcs kiszélesedés)

3. Szililezıszer szénláncán terminális -NH₂ helyezkedik el ⇒ ráhajlik a mellette lévı szilanolra, blokkolja ⇒ „víztőrı fázisok”

(vízzel vagy puferrel használhatók szerves módosító nélkül)

Monomer és polimer fázisok megkülönböztetése Szilanolcsoportok konverziójának mértéke

OH c

x

OH

α

≈ α

α_{C :} a felületen az alkilcsoport koncentrációja (µmol/m²) α_OH : a szilanolcsoportok koncentrációja (µmol/m²)

A szilanolcsoportok konverziójának értéke:

X_OH < 1 monomer módosítású fázis 0,5 < X_OH < 1 átmeneti módosítású fázis X_OH > 1 polimer módosítású fázis

A ligandumok méretének hatása az elválasztásra

HPLC-ben: C₂, C₄, C₈, C₁₈ és újabban C₃₀ szénláncokat visznek fel Az alkillánc hosszának hatása a retencióra

Már a C₁₂ is jó (telítés)

Az alkillánc hosszának hatása a szelektivitásra

itt is telítési görbe: k és

α

között kapcsolat van!

Az alkillánc hosszának hatása a hatékonyságra

maximum oka:

•C₂ borítás esetén kölcsönhatás a szilanolcsoportokkal

adszorpció lép fel: gátolt anyagátmenet: sávszélesedés

•C₃₀ borítás esetén a molekula túl sokáig diffundál az apoláris rétegbıl vissza a mozgófázisba

• optimális: elegendıen hosszú lánc: nincs számottevı kölcsönhatás a felülettel és elég gyors a diffúzió

Az állófázisok pH stabilitása (2<pH<8) Tartósan magas pH esetén: pontkorrozió

a pórus átszakad, a szemcse összeomlik

nagy iontartalom növeli az oldhatóságot: nagy koncentrációjú puffer használata nem elınyös

magasabb pH: pH tőrı állófázisok

Felsı pH növelése: hibrid technológia Szerves és szervetlen töltet egyszerre

Si-O-Si- kötések mellett –Si-CH₃ kötések

Xterra: pH 1-12 tartományban stabil

Tartósan alacsony pH esetén (pH <<<< 2) Az alkilláncok hidrolízis sebessége nı

Új tipusú töltet: a klórszilán –CH₃ csoportok helyett 2-propil, i-butil-csoportot tartalmaz: -O-Si- kötéshez való hozzáférés csökken

Poláris csoportot is tartalmazó fordított fázisú töltetek savamid (–NH-CO-R) csoportot, kvaterner ammóniumiont

építenek be:

lehetséges kölcsönhatások:

•H-híd

•ioncsere (alacsony pH: -NH₂⁺-)

Nem szilikagél alapú fázisok

Szerves polimer alapú állófázisok: sztirol-divinilbenzol kopolimer

• kevésbé nyomástőrı (keresztkötések számával javítható)

• duzzadhatnak: (bizonyos szerves oldószereket csak kisebb koncentrációban vagy egyáltalán nem lehet alkalmazni)

• pH stabilitás: 1< pH < 14

hátrány:

mikropórusok keletkezése

kinetikai hatékonyság csökken

DVB növelése: keresztkötés ⇒

mechanikai stabilitás növelés

Komponens-állófázis kölcsönhatások:

Aromás-aromás (π-π)

aromás-apoláris kölcsönhatások

Aromás győrőre -C₁₈H₃₇ csoportot építenek: kapcsolat az oktadecil- szilika kolonnákkal

ez is egy C₁₈ töltet

Szerves polimer fázis rosszul nedvesíthetı

Nedvesíthetıség növelésére ionos (ionizálható) csoportokat építenek be:

Többfunkciós szerves polimer alapú töltetek

Apoláris oldalláncok, aromás csoportok: hidrofób kölcsönhatás

Piridin bázis protonált formája: ionos kölcsönhatás (anioncsere)

Apoláris oldalláncok, aromás csoportok: hidrofób kölcsönhatás

Szulfonsav csoport (pH kontroll): ionos kölcsönhatás (kationcsere)

Szerves polimer fázisok kritikus pontja a nyomástőrés Szemcsék összelapulnak végül összeroppannak

Szerves polimer fázisok elınyei:

• pH tartomány: 1-14

• szemcseátmérı eloszlás jó

• energetikailag gyenge kölcsönhatás (tiszta RP)

• szinte végtelen élettartam

• reprodukálható sarzsok

Szerves polimer fázisok hátrányai:

• kisebb hatékonyság (N)

• lassúbb egyensúly beállás

• rosszabb nedvesíthetıség

• limitált maximális nyomás

• klórozott szénhidrogénekkel nem kompatibilis

Szén alapú állófázisok

Kezdetben: szén mint adszorbens nem lineáris izoterma, mechanikai instabilitás jellemezte

Knox és Gilbert porózus grafitizált szén (PGC) elıállítás lépései

• nagy porozitású, 5 µm szemcseátmérıjő szilikagél

• pórusokat fenol-formaldehid monomerrel töltik fel

• fokozatosan 150°C-ra hevítik, hogy fenol-formaldehid gyanta képzıdik a pórusokban

• ezt a gyantát fokozatosan 900°C-ra hevítik N₂ áramban ⇒szilárd szilikagél váz szénnel töltött pórusokkal

• 5M KOH oldattal a szilikagélt kioldják ⇒ gömbszimmetrikus szén részecskék (inverz alakja a szilikagélnek)

• pórusátmérı kisebb mint 30Å, fajlagos felület 400 m²/g

• Szenet oxigén-argon atmoszférában hevítik, mikropórus

átrendezıdik, makropórus keletkezik, visszamarad a sík, kristályos felület ⇒ HYPERCARB

3. Egyéb töltetek

•Titán-dioxid alapúak

•Zirkónium-oxid alapúak

•Zeolit típusúak

Oszlop anyaga:

•saválló acél

•üveg

•PEEK (poli(éter-éter-keton))

Oszlop méretei:

átmérı: 2-5 mm hossz: 5-25 cm

Töltet:

(irreguláris)

szférikus

Kolonnák

Töltetek

porózus részecskék

(szivacs-szerő szerkezet) átmérı: 3-10 µm

pórusok belsejében: diffúzió

nem-porózus részecskék

nincs belsı felület:

nincs (elhanyagolható) diffúzió átmérı: 1-2 µm

nagy nyomás

kicsiny mintakapacitás

„átjárható” részecskék:

átjárható pórusok: 600-800 nm diffúziós pórusok: 80-150 nm 20 µm-es részecskék

kicsiny ellenállás

monolit töltet:

pórusos rúd

kicsiny ellenállás

kedvezı tulajdonságok

Töltetek

„héjszerkezető” töltet:

az állófázis porózus külsı héjat alkot egy áthatolhatatlan szemcse felületén

ötvözi a porózus és a nem-porózus töltet kedvezı tulajdonságait

Töltetek

H = A + B/u + C * u

H [mm]

u [cm/s]

C * u

H_min

u

Folyadékkromatográfiás mozgófázisok

A mozgófázisokkal szemben támasztott követelmények

1. az oldószer polaritása (módszer specifikus: normál, fordított fázisú kromatográfia)

2. az oldószer viszkozitása

3. az oldószer UV-fényáteresztése 4. az oldószer tisztasága

5. az oldószer forráspontja 6. az oldószer oxigén tartalma 7. az oldószer víztartalma

8. elegyíthetıség 9. ártényezık

Normál fázisú kromatográfia (NP-HPLC) mozgó fázisai

1. Az oldószer polaritása

Az oldószernek vagy az oldószerelegynek a rendszer által meghatározott polaritásúnak kell lenni. Ez a módszerspecifikus feltétel.

Olyan oldószert vagy oldószerelegyet kell választani, hogy a legkevésbé visszatartott komponensre is igaz legyen:

k’ > 1

2. Az oldószer viszkozitása, nyomásesés a kolonnán

Az alkalmazott oldószerek viszkozitása általában η < 1, ezért 25°C-on 1 cm³/perc vagy nagyobb térfogati áramlási sebességgel dolgozhatunk

•NP-HPLC-ben az u növelésével H minimálisan növekszik: nagyobb áramlási sebességekkel dolgozhatunk: rövidebb analízis idı

•kis viszkozitású oldószerekkel gyorsabb az anyagcsere az álló- és a mozgófázis között (kisebb sávszélesedés)

Lε

∆P η

u K

=

o

Darcy törvénye:

3. Az oldószer UV-fényáteresztése

Uv cut-off: transzmittancia 90%-ra csökken Legtöbbször UV-Vis detektort alkalmazunk

Izokratikus vagy gradiens eluciónál más-más tisztasági fokú oldószereket kell alkalmazni (chromatographic grade; gradient grade; ultra pure grade)

A szennyezések az állófázis felületét átalakítva (fıleg gradiens elució esetén) megváltoztatják az elválasztást

100T (%)

λ(nm) 90%, UV cut off

4. Az oldószerek tisztasága, toxicitása

A szerves oldószerek (fıleg a halogén tartalmúak, CCl₄, CHCl₃, stb.) egészségre ártalmasak

5. Az oldószerek forráspontja

Alacsony forráspontú oldószereknél nagyobb a buborék képzıdés esélye (pentán: hőthetı-főthetı termosztát).

Ciklo-hexán esetén nagyobb nyomásnál (250 bar) a ciklo-hexán megszilárdul (dugattyútörés).

6. Az oldószerek oxigéntartalma

Az NP-HPLC-ben használt oldószerek kb. ugyanolyan mértékben oldják az oxigént, nincs gázkiválás. (Az NP-HPLC-ben ritkán gázmentesítünk.)

7. Az oldószerek víztartalma

Szilikagél-alapú állófázison a víz hatása elkerülhetetlen: a gyártás során a víz H-hidas kötéssel kötıdik a szilanolcsoportokhoz, ezt a vizet még hıkezeléssel is nehéz eltávolítani.

Abszolutizált oldószereket használva ez a víz fokozatosan lejön ⇒ reprodukálhatatlan retenció

Metanol hasonlóan viselkedik mint a víz.

Kémiailag módosított állófázisokon a víz hatása kisebb: a legaktívabb helyek le vannak már kötve a módosítóval.

Víz hatásának kiküszöbölése:

•Vízzel telített mozgófázisok alkalmazása (nem jó: a víz adszorbeálódik a pórusokban, nem szilárd-folyadék hanem folyadék-folyadék kromatográfia esete áll fenn

•Néhány tized% 2-propanol alkalmazása kikerüli a víz okozta problémákat

8. Ártényezık

Szénhidrogének, különösen egyes perfluorozott szénhidrogének ára meglehetısen magas.

Az 1.-8. pontban felsorolt igényeknek egyetlen oldószer sem felel meg!

Oldószer elegyeket használunk!

„A” oldószer: biztosítja a nagy retenciót

„B” oldószer: a megadott tartományba állítja a retenciót. Ezzel a poláris oldószerrel állítjuk be az adszorbens aktivitását.

eluenserısség:

alap: szénhidrogén poláris modifikátor

Alap oldószerek („A” oldószerek)

•n-hexán

•n-heptán

•i-oktán

Oldhatóság növelı oldószerek

•diklórmetán

•diklóretán

•kloroform (etanollal stabilizált)

Módosító szerek (modifikátorok; „B” oldószerek)

Az állófázis legaktívabb helyein kötıdnek, homogenizálják a felületet.

lokalizáltan adszorbeálódók: erıs H-híd kötések, a mintamolekula nem szorítja le az állófázisról

nem lokalizáltan adszorbeálódók: gyenge H-híd kötések, a mintamolekula leszorítja az állófázisról a módosítószert, szelektivitás nı modifikátor kötıdése: alkohol > észter > éter

Leggyakrabban használt oldószerek polaritása és retenció összefüggések az NP-HPLC-ben

Az NP-HPLC-ben használt oldószerek eluens erıssége Az elúciós erısségi skálát Snyder dolgozta ki

Az elúciós erısségi skála alapja az oldószer adszorpciós hıje alumínium-oxidon:

a pentán adszorpciós hıjét 0-nak tekinti, a többi oldószert ehhez viszonyítja

Minél nagyobb az oldószer kölcsönhatása az állófázissal, annál nagyobb az adszorpciós hı

Az oldószer erısség,

εεεε

⁰ egy dimenziómentes szám, mely megegyezik az oldószernek egységnyi felületre normalizált adszorpciós hıjével A szilikagél felületi aktivitása nagyobb mint az alumínium-oxidé, így a poláris oldószerek adszorpciós hıje is nagyobb, az eluens erısségük nı; összefüggésük:

ε

⁰szilikagél = 1,10

ε

⁰aluminium-oxid

Az NP-HPLC-ben használt oldószerek eluens erıssége

Snyder modellje az adszorbens egyrétegő (mono-molekuláris) borítottságán alapul

S_m + nB_s S_s + nB_m S

B B B S

B

B

B

[ ][ ] [ ][ ]

m s ⁿ

n m S

B S

B

K = S lg K = lg V

a

+ β ( S

e

− n ε

B

)

•V_A- adszorpciós térfogat (d_f*A_S); Se- S molekula adszorpciós energiája; ε_B- oldószer egységnyi felület/molekula felület adszorpciós energiája; β- adszorbens aktivitási

tényezı.

•d_f

•ε_B- oldószererısség mértékét jellemzi (kiinduló értéke 0, pentán alumínium-oxidon)

Fordított fázisú kromatográfia (RP-HPLC) mozgófázisai

Az oldószerrel szemben támasztott általános követelmények megegyeznek az NP-HPLC mozgófázisaira megismertekkel

Módszerspecifikus követelmény:

A mozgófázis polárisabb mint az állófázis.

Ennek a követelménynek a víz felel meg a legjobban Uv cut-off: 190 nm

Viszkozitás:

η

^{= 1 cP}

A szerves molekulák nagy része nem oldódik vízben: szerves oldószer adagolása

RP-HPLC-ben alkalmazott szerves oldószerek

Problémák:

• etanol és 2-propanol viszkozitása nagy

• dioxán polaritása ugyan nagy, de mérgezı

• tetrahidrofurán (THF): peroxid képzıdés elkerülésére 3,5-

diizobutil-4-hidroxi-toluolt tartalmaz: ez adszorbeálódik a kolonnán és 280 nm-ig elnyeli a fényt (UV cut-off)

• acetonitril: kellı tisztaság biztosítása probléma (tisztaság ellenırzés gradiens elúcióval; lásd: detektorok)

Az alkoholok vízzel H-hidas kölcsönhatásba lépnek, a biner elegyek viszkozitása maximum görbe szerint változik

Az etanol és a 2-propanol esetén a maximum még nagyobb értékő.

Az acetonitril vízzel dipól-dipól kölcsönhatást létesít, mely gyengébb mint a H-híd, a görbe lefutása laposabb.

egyre kisebb szemcseátmérıjő (d_p) kolonnák kerülnek forgalomba, a belépı nyomás (

∆

p) nı, ezért az acetonitril sokkal kedvezıbb mint a

metanol

A viszkozitás a hımérséklet növelésével csökken

De: magasabb hımérsékleten dolgozva a kolonna élettartama csökken

Eluenser ı sség

Nem olyan egyértelmően definiálható mint az NP-HPLC-ben: a felület változása miatt az adszorpciós hı meghatározása nem egyértelmő

Nagy ligandum borítottságú felületnél csak diszperziós kölcsönhatás (hidrofób-hidrofób ) lép fel, ami a kölcsönhatási felületek nagyságával arányos

RP-HPLC-ben használatos oldószerek eluotróp sora

víz < metanol < acetonitril < etanol < 2-propanol < THF eluciós erı

szelektivitás

Kinetikai hatékonyság változása biner elegyek esetén

A víz - 2-propanol elegy alkalmazásának korlátja nemcsak a nagy viszkozitás, hanem a kinetikai hatékonyság csökkenés. (A kettı összefügg: Wilke-Chang egyenlet)

A szelektivitás függése a módosítószertıl

Tökéletesen borított állófázis nincs (szabad szilanolok)

Kérdés: hogyan jut a mintakomponens a szabad szilanolokhoz különbözı módosító esetén?

Az alkilláncok taszítják a vizet, de módosítószertıl függıen a C₁₈ lánc különbözıképpen szolvatálódik, különbözı vastagságú adszorbeált réteg alakul ki

Metanol: a megkötött oldószerréteg vastagsága kicsi, adszorpció jöhet létre a mintakomponenssel a felületen, ami erısebb, mint az abszorpció

THF: a C₁₈ láncok jól szolvatálódnak a tetrahidrofuránban, vastag az adszorbeált réteg, a mintakomponens abszorbeálódik a szolvatált rétegben, gyengébb a kölcsönhatás mint a metanolos rétegben

Acetonitril: a kettı közötti szolvatáció, adszorpciós-abszorpciós kölcsönhatás

Molekuláris szinten:

Metanol: a C₁₈ láncok nem szolvatálódnak jól, a felület

közelében vannak, beborítják a felületet ⇒ elzárják az utat a szilanolcsoportokhoz („hidrofób zár”)

THF: a C₁₈ láncok jól szolvatálódnak, kinyílnak, „lobognak a felületen ⇒ még több szilanolhoz való hozzáférést biztosít

Acetonitril: a kettı közötti szolvatáció, kevesebb szilanolhoz való hozzáférés, mint THF esetén

Ha a mintakomponens erıs H-híd kötésre hajlamos, THF alkalmazásával növelhetjük a kölcsönhatás valószínőségét a szilanolcsoportokkal

A szelektivitás csökkenését víz-metanol-THF terner rendszerrel javíthatjuk

Toxikusság

Szerves oldószerek mind károsak az egészségre Pufferek használata

Ionos és könnyen ionizálható anyagok vizsgálata: pH kontroll

Ismerni kell a komponensek pK_a értékét és az alkalmazni kívánt anyag pufferkapacitását

Puffer használata: csökkenti a kolonna élettartamát Pufferek speciális alkalmazása: ionpár kromatográfia Pufferekkel szemben támasztott követelmények:

• alacsony cut-off hullámhossz

• nagy pufferkapacitás

• szilárd anyag mentesség (szőrés)

• pufferkompatibilitás: nagy szerves anyag tartalomnál ne váljon ki

Ionkromatográfia

(IC: Ion Chromatography)

Ionok elválasztása: eltérı sebességgel haladnak át egy megfelelıen megválasztott oszlopon

Ioncserélı gyanták

1971: „forced flow chromatography”:

N₂ gáz +UV-Vis spektrofotometria: Fe(III) elválasztása

HPLC fejlıdése megteremtette a mőszeres hátteret az IC fejlesztéséhez hiányoztak a detektorok (klasszikus HPLC detektorok nem alkalmasak)

1975: vezetıképesség-mérésen alapuló detektálás: modern IC

elválasztásért felelıs oszlop szulfonált polisztirol-DVB

kicsiny ioncserekapacitás: 0,02 mmol/g

„elnyomó” oszlop

nagy ioncserekapacitás

Ionkromatográf: Dionex Co.

Kationokra: spektrofotometriás meghatározások léteztek korábban is Anionokra kicsiny koncentrációban (ppm) nem volt analitikai módszer

Ionkromatográfia

(IC: Ion Chromatography)

nagyhatékonyságú analitikai módszer kvalitatív & kvantitatív információk

összetett minták analízise

a mintát alkotó komponensek szétválasztása

Mozgófázisa: folyadék Állófázisa: ioncserélı technikai kivitelezés: oszlop (kiszorításos), elúciós analízis Minta halmazállapota:

folyadék

elválasztás: álló- és mozgófázis közötti ioncsere-egyensúlyon alapul szervetlen és szerves ionok elválasztására

Ionkromatográf felépítése: hasonló a HPLC-hez

Elúciós analízis

leggyakrabban alkalmazott technika

•az állófázisra juttatott minta mennyisége igen kicsiny

„elhanyagolható” az eluenséhez képest

•nincs szükség regenerálásra

1. nem szorbeálódó eluens folyamatos átáramoltatása 2. minta bevitele

3. elúció

idı jel

integrális detektor

Analitikai információ:

minıségi: t (retenciós idı) mennyiségi: csúcs területe

idı jel

differenciális detektor

t_A t_B

Pillanatnyi különbséget mérnek az áthaladó eluens összetételében.

A detektort elérı mintakomponens(ek) felgyülemlett mennyiségét méri.

A

B

Minta: A & B

A: kevésbé kötıdik

Állófázis:

•térhálósított mőgyanta (pl: polisztirol-divinilbenzol kopolimer) vázon ioncserélı funkciós csoportok

•módosított szilikagél

Ioncserélık:

•kationcserélık

•anioncserélık

Ioncserélık:

•erıs

•gyenge erıs kation: -SO₃H (szulfonsav)

gyenge kation: -COOH

erıs anion: kvaterner aminocsoport gyenge anion: primer aminocsoport

n RSO₃H + Mⁿ⁺ (RSO₃)_nMⁿ⁺ + n H⁺ Kationcserélı:

anioncserélı:

n RN(CH₃)₃OH + A^n- [RN(CH₃)₃]_nA + n OH^-

Ionok megkötıdése függ:

méret töltés

hımérséklet ionerısség

pH

Állófázis:

pórusos gyanták: diffúzió: csúcs kiszélesedés

hatékonyság növelése: felületi porózus réteg: éles csúcsok (kicsiny minta kapacitás) Mozgófázis:

Kationok elválasztása: erıs sav híg (vizes) oldata Anionok elválasztása: erıs bázis híg (vizes) oldata

Detektor: vezetıképesség mérés

eluens: nagy a vezetıképessége: nagy háttérjel szupresszor oszlop: vezetıképesség „elnyomó”

kompetíció a H⁺ (OH^-) és a Mⁿ⁺ (A^n-) között az ioncserélı helyeken

Kationcserélı analitikai oszlop: nagykapacitású anioncserélı szupresszor

n RSO₃H + Mⁿ⁺ (RSO₃)_nMⁿ⁺ + n H⁺ Kationcserélı:

Analízis:

Elnyomás: H⁺ semlegesítése (eluens + minta)

n RN(CH₃)₃OH + A^n- + nH⁺ [RN(CH₃)₃]_nA + n H₂O A^n-: az eluens anionja

az eluens anionja megkötıdik és vele ekvivalens mennyiségő hidroxidion kerül az oldatba

lecserélıdik az analitikai oszlopon elválasztott kation ellenionja is:

ekvivalens mennyiségő OH^- jut az oldatba

& kationok

vezetıképesség mérés

eluens tároló pumpa adagoló

detektor PC

analitikai kolonna

ionelnyomó kolonna

ionelnyomásos IC

(KCl meghatározás acidi-alkalimetriásan)

Szupresszor oszlop:

regenerálást igényel

csúcs kiszélesedét okoz – hatékonyság csökkenés Gyenge savak anionja nem meghatározhatók:

savas forma kicsiny vezetıképesség-változást eredményez

Kicsiny ioncserekapacitású oszlopok megjelenése: nem szupresszált rendszerek

anionok elválasztása: kationcserélı szupresszor

TÖLTET-E^- + A^- TÖLTET-A^- + E^- Anioncserélı:

nem szupresszált rendszer (nincs szupresszor oszlop):

kicsiny vezetıképességő mozgófázis alkalmazása

eluens tároló pumpa adagoló

detektor PC

analitikai kolonna egykolonnás (nem szupresszált) IC

Mozgófázis:

•benzoesav

•ftálsav

•borkısav

•citromsav

Detektor:

•vezetıképesség mérés

•UV-Vis

Töltetek fejlıdése: hatékonyság növekedés: folyamatosa növekvı számú alkalmazás töltettel szemben támasztott követelmények:

•lehetı legnagyobb tányérszám

•töltet/eluens rendszer: gyors egyensúly (kinetikus csúcs kiszélesedés minimalizálása)

•retenciós idık: se túl nagy, se túl kicsi

•töltet/eluens rendszer: detektorral kapcsolható legyen 1980’

Az oszlop

Oszlop anyaga:

•saválló acél

•PEEK (poli(éter-éter-keton))

Oszlop méretei:

átmérı: 1-8 mm hossz: 3-30 cm Töltet:

polisztirol-DVB kopolimer módosított szilikagél

cellulóz alapú

kicsiny (µm) szemcsék (HPLC)

különbözı mérető pórusok:

mikro & makro pellikuláris töltet:

az állófázis porózus külsı héjat alkot egy áthatolhatatlan szemcse felületén

szerves polimer-alapú töltetek:

kevésbé nyomástőrı (keresztkötések számával javítható)

duzzadnak: szerves oldószer csak kisebb koncentrációban alkalmazható pH stabilitás: 1< pH < 14

szilikagél: pH: 3-8

HO3S SO

3H HO3S

HO3S

Kationcserélı

kicsiny ioncserekapacitás: felületi módosítás

R3

+NCH

2

CH2N⁺ R

3

CH2N⁺ R

3

CH2N⁺ R

3

Anioncserélı

kicsiny ioncserekapacitás: felületi módosítás

Módosított szilikagél

SiO₂

OH OH

OH OH OH

H = A + B/u + C * u

A van Deemter egyenlet általános ábrázolása

H [mm]

u [cm/s]

A

C * u B/u

szabálytalanabb töltet: nagyobb áramlási egyenlıtlenségek kisebb szemcseméret: kisebb egyenlıtlenségek

H_min

u

Mintaadagolás

1. a mintát pillanatszerően kell bejuttatni az eluensbe 2. keveredjen el az eluenssel (OLDHATÓSÁG)

minta térfogata: 10-50 µl (nincs térfogatváltozás) mikroliterfecskendı:

hatutas bemérı szelep A bevitt minta térfogatát az adagolón elhelyezett hurok („loop”) térfogata

határozza meg.

alternáló mozgást végzı, kis dugattyú-térfogatú pumpa

(reciprocating pump)

térfogat: 10-100 µl

továbbított folyadék mennyisége: korlátlan áramlási sebesség változtatása:

•löket hossz

•dugattyú sebessége

pulzálás: jelentısen csökkenthetı: ikerfej alkalmazása (fáziseltolás)

V

idı

DETEKTOROK

Az eluenst alkotó ionok jelenlétében képesnek kell lennie, a minta ionjainak mérésére.

•csak a mintát alkotó komponensekre ad válaszjelet

•csak az eluenst alkotó komponensekre ad válaszjelet (indirekt detektálás) Eluens megválasztása: minél kisebb detektorjel

Detektorok

Kolonna: idıben (térben) elválasztja az egyes alkotókat

Az adott komponens az eluenssel (vivıgázzal) együtt beáramlik a detektorba.

mennyiségi analízis: a detektor által elıállított jel arányos az anyag koncentrációjával vagy idıegység alatt bejutott mennyiségével

univerzális: minden molekulára ad jelet

szelektív: bizonyos vegyülettípusokra ad jelet specifikus: csak bizonyos molekulákra ad jelet

destruktív nem destruktív

dinamikus tartomány: az a koncentráció tartomány amelyben a koncentráció változása detektorjel változást eredményez

lineáris tartomány: T= mc (eltérés < 5 %)

érzékenység: m (egységnyi koncentrációváltozás hatására bekövetkezı jelváltozás) kimutatási határ: az a koncentráció, melynek mérésénél a detektor válaszjele

egyértelmően megkülönböztethetı a háttértıl (LOD)

meghatározási határ: az a legkisebb koncentráció, amely megfelelı precizitással és pontossággal meghatározható (LOQ)

UV-Vis spektrofotométer

Alkalmazható: UV-Vis tartományban elnyel az adott komponens

Lambeert-Beer:

A_λλλλ = ε_λλλλ c l

Fényforrás:

UV: deutérium lámpa Vis: volfrám lámpa

rés

fényforrás

monokromátor

„fényosztó”

(splitter)

D E T E K T O R

referencia ág mérı ág cella (küvetta)

I₀

I₀ I₀

I

Detektor:

fotodióda

Cella:

kvarc küvetta l=5-10 mm

A = lg I₀/I

Diódasoros detektor DAD (Dioda Array Detector)

polikromátor

fényforrás lencse

cella (küvetta)

diódasor

Elıny:

különbözı hullámhosszúságon mért elnyelések egyidejő mérése spektrum felvétele: minıségi információ

Fluoreszcencia mérésen alapuló detektor

fluoreszkáló anyagok detektálása

rés

fényforrás

monokromátor

cella (küvetta)

monokromátor

Detektor:

a kibocsátott fényt méri

pl. festékanyagok

Vezetıképesség mérésen alapuló detektor

Vezetıképesség: G [Siemens] 1/R

Ha egy elektrolit oldatba két azonos mérető, sík felülető, párhuzamos elektródlap (pl. Pt- lap) merül, amelyek felületének nagysága A, a köztük levı távolság pedig l, akkor az így kapott vezetıképességi cellára igaz, hogy

K=A/l: cellaállandó (geometria)

κκκκ: fajlagos (specifikus) vezetıképesség: megadja a két, egységnyi (1 cm²) felülető, egymástól egységnyi távolságra (1 cm-re) levı elektród között levı elektrolitoldat vezetıképességét oldatok vezetıképessége: additív tulajdonság

Függ:

ionok minıségétıl (mozgékonyság) ionok számától (koncentráció)

Semleges molekulák: nem detektálhatók

Elv: 2 elektród (acél) elhelyezve az áramlási cellában megfelelı feszültség: áram folyik

Áramerısség:

töltés, méret, koncentráció, oldószer, hımérséklet Egyenfeszültség: elektrolízis veszélye

Váltakozó feszültség: 100-10 kHz, U= 20 V

„Érintkezés mentes” cella