Mi minősül „új anyagnak”?

Új kábítószerek

szerkezetazonosítása, speciális vizsgálatok,

referenciaanyagok

Balatoni István Boros Sándor

igazságügyi vegyészszakértő igazságügyi szakügyintéző Nemzeti Szakértői és Kutató Központ

Kábítószervizsgáló Szakértői Intézet

balatoni.istvan@nszkk.gov.hu boross@nszkk.gov.hu

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem 2019. március 5.

Anyagvizsgálati módszerek a bűnüldözésben 5. Előadás

Budapesti Műszaki Egyetem

Mi minősül „új anyagnak”?

Számunkra új az az anyag, amely hazánkban korábban még nem fordult elő lefoglalásokban, nem azonosítottuk.

Analitikai adatok:

•nemzetközi adatbázisokban megtalálható ☺

•nem található az adatbázisokban

2

Új az „új”?

1930-as évek (USA): az amfetaminok depresszió ellen ható, fogyást elősegítő, légúti

megbetegedések ellen bevezetett készítmények hatóanyagai

Képek: Am J Public Health. 2008 June; 98(6): 974–985.

Példa katinonok megjelenésére

Példa katinonok megjelenésére

1960-as évek (USA): függőség nagy számban volt felismerhető, hosszútávú mellékhatások megjelenése, a helyzet válságossá vált, kísérletek indultak hasonló hatású, kevésbé addiktív és káros mellékhatásoktól mentes szerek kidolgozására.

1971: ENSZ pszichotróp egyezmény - az amfetamin és egyes származékai is listára kerültek

ANDREAS J ROTTENDORF CHEMISCHE FABRIK

1969

THERAPEUTICALLY ACTIVE SECONDARY AND TERTARY 1-HALOGENPHENYL-2-AMINO-

ALKANONES 1967

Appetite-suppressing and weight reducing composition

Triptaminok és fenetilaminok

- önkísérletek, adagok

Alexander Theodore

"Sasha" Shulgin (June 17, 1925 – June 2, 2014) was an American medicinal chemist

Kannabinoidok

http://www.leafscience.com/2013/09/25/the-surprising-origins-of-synthetic-marijuana/

John William Huffman , Clemson University

C&EN, Volume 88 Issue 26 , p. 43 June 28, 2010

Journal of Pharmacology &

Experimental Therapeutics (1998, 285, 995).”

Alexandros Makriyannis Northeastern University

•AM-087— an analgesicCB₁ agonist derived from Δ⁸THC substituted with a side chain on the 3-position, it has a K_i of 0.43nM making it roughly 100x as potent as THC.

•(…)

•(…)

•cannabinoid receptors with some selectivity for CB₂.

•AM-2201— a potent agonist at both CB₁ and CB₂with moderate selectivity for CB₁, with a K_iof 1.0nM at CB₁ and 2.6nM at CB₂.

•AM-2212— a potent agonist at both CB₁ and CB₂with dodecal selectivity for CB₁, with a K_iof 1.4nM at CB₁and 18.9nM at CB₂.^[5]

https://en.wikipedia.org/wiki/List_of_AM_cannabinoids

AM-2201

Kannabinoidok

Mire számíthatunk?

Milyen anyagban találhatunk új hatóanyagot?

•Por

•Tabletta

•Növényi anyagra abszorbeált/impregnált hatóanyag

•Bélyeg / papír

•Tárgyak felületén jelenlévő anyagmaradvány

Mire számíthatunk?

Milyen molekulára bukkanhatunk?

•Szerves kismolekulák (erre vagyunk berendezkedve, így pl. fehérje mérgeket nem tudunk azonosítani)

0 20 40 60 80 100 120 140

<100 100-200 200-300 300-400 400-500 >500

darab

M_r

Magyarországon azonosított új anyagok M_r eloszlása (2008-2019)

Ezt kaptuk:

11

• Felismerés: túl vagyunk a rutin analitikán, nincs egyezés

a könyvtárakban lévő spektrumokkal, új anyaggal állunk

szemben.

Stratégia (út a szakvéleményig)

12

Rutinvizsgálatok

Ismeretlen komponens

Szerkezet- meghatározás

Sikeres?

Félreérthetetlen azonosítás

Elég tiszta a szerkezet- vizsgálatokhoz

igen

nem

kromatográfia extrakció

átkristályosítás, desztilláció

Ismeretlen anyag

Spektrumkönyvtári keresés

riport

Van ötlet a szerkezetre?

Megválasztott technikák

Teljes karakterizálás

nincs van nem

igen

homogenizálás extrakció

Szerkezet- vizsgálat

átkristályosítás

Ismeretlen anyag kinyerése

mintaelőkészítés az analízisre

kromatográfia

Mennyire részletes

szerkezetvizsgálatra van szükség?

Izomerek

Konstitúciós izomerek

•Láncizomerek

•Regio-izomerek (ipso, orto, meta, para)

•Funkciós izomerek

•Tautomerek (enol-oxo) nem jellemző Térizomerek

•Geometriai izoméria (cisz-transz)

•Optikai izoméria (diasztereomerek, centrális enantiomerek)

A jogban jelenlévő szerkezetleírások (egyes vegyületek kémiai/IUPAC neve, generikus leírás) határozzák meg azt milyen mélységig kell a szerkezetet bizonyítani. Azonban az analitikus számára sokszor jelent előnyt bizonyos izomériák lehetőségének felismerése adott rendszerben

pl. enol-oxo tautoméria, diasztereomerek elválása kromatográfiás körülmények között

Láncizomerek

Regio-izomerek

Funkciós izomerek

Enantiomerek

A jog nem tesz különbséget, de egyetlen kivétel van:

Tömegspektrometria (MS) (destruktív módszer)

18

GC-MS

LC-MS

HPLC-qTOF

Pontos molekulatömeg Fragmentáció

Fragmentáció

Fragmentáció

Nem destruktív módszerek

19

*https://classconnection.s3.amazonaws.com/255/flashcards/4013255/jpg/electromagneticspectrum-141B490BAC872789434.jpg

Röntgen-diffrakció

UV-VIS

FTIR, RAMAN NMR

*

Nuclear Magnetic Resonace (NMR) mágneses magrezonancia

spektroszkópia

21

Isolation, Structure, and Partial Synthesis of an Active Constituent of Hashis, Y. Gaoni, and R. Mechoulam, J. Am. Chem. Soc., 1964, 86 (8), pp 1646–1647

Delta-9-THC szerkezetmeghatározása

Az első kereskedelmi forgalomban kapható NMR készülék

NMR - szerkezetfejtés

1H NMR spektrum

Kémiai eltolódás szerkezetfüggése:

Magok hibridállapota

• 0,0 – 1,5 ppm sp³ C – ¹H, sp³ C szomszéd maggal

• 1,5 – 2,5 ppm sp³ C – ¹H, sp² C szomszéddal

• 2,5 – 4,5 ppm sp³ C – ¹H, heteroatom szomszéddal

• 4,5 – 6,5 ppm sp² C – ¹H

• 6,5 – 8,0 ppm aromás C – ¹H Szomszédos magok elektronegativitása

Pl. halogének elektronszívó hatásuk miatt csökkentik a mag körüli e- sűrűséget ->

növelik a kémiai eltolódást

Elektronsűrűséget befolyásoló összes tényező (pl. mátrix hatás)

Jelfelhasadás szabály:

k=2NI+1 N:szomszédos csatolt magok száma; I: spin

I=1/2 spin és egymás közötti ekvivalencia esetén k=N+1

1 H-NMR Kémiai eltolódás diagram

Példa C10H13NO

Példa C10H13NO

Példa C10H13NO

13 C-NMR kémiai eltolódás diagram

Példa C10H13NO

Példa C10H13NO normefedron

2-amino-1-(4-methylphenyl)propan-1-one

Példa C11H15NO

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000

m/z-->

Abundance

58.0

91.0

30.0 42.0 119.0

77.0 105.0 134.0 162.0

Pé ld a C 1 1 H 1 5 N O

2704.74 2459.23

1686.92 1606.14

1456.36 1358.63 1298.54 1247.74 1187.57 1102.54 1031.85 1006.24 974.48 899.74 832.20 756.05 687.72

100015002000250030003500

Wavenumber cm-1

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Absorbance Units

Ujjlenyomat tartománydeformációs rezgések vegyértékrezgések

REFERENCIAANYAGOK

Probléma:

• Nem elérhető kereskedelmi forgalomban a szükséges referencia anyag

• Nem várhatunk, 60+30 nap alatt ki kell adni a szakvéleményt (új pszichoaktív

anyagnak minősülő új anyagról be kell bizonyítani, hogy jogi határ alatti vagy fölötti mennyiségről van e szó)

• A megfelelő minősítéssel rendelkező referencia anyagok drágák

• HPLC az igavonó a mennyiségi meghatározásokban, de szüksége van referencia anyagra

Megoldás:

• Referencia anyagok házi szintézise

• Kvantitatív NMR (qNMR) alkalmazása.

• Előnye: mely nem igényel a mérendő anyaggal azonos kémiai szerkezetű referencia anyagot, elválasztástechnikát nem igényel

• Hátránya: elválasztástechnika hiányában a bonyolultabb mátrixok a mérendő anyagon kívüli NMR aktív komponensei meghiúsíthatják a mérést. Ekkor csak a HPLC a megoldás.

Referenciaanyagok

Tesztvásárlás Házi szintézissel

előállított

Lefoglalt anyag

Házi referencia

anyag jelölt

Házi standard minősítése

Yes

No Szabadbázis

feltárás, tisztítás, HCl-só képzés

Tisztítás

Homogenizálás I

Választott analitika (VRK, GCMS, NMR, IR stb.

qNMR

HPLC-DAD homogenitás teszt

GC-MS

Olvadáspont

ATR-FTIR

Finom homogenizálás II

Házi referencia anyag jelölt

Só

?

Technika Szerkezet információ

Tisztaság Szennyező

NMR Egyes szénhidrátok, oldószermaradványok,

melléktermékek, rokonszennyező (izomer, homolog stb), kiindulási anyag

egyéb szerves szennyezők ATR-FTIR Szénhidrátok, oldószermaradványok,

kristályoldószerek,

melléktermékek, rokonszennyező (izomer, homolog stb), kiindulási anyag

egyéb szerves szennyezők, szervetlen és szerves sók, regio-izomerek

Olvadáspont - Sejthető, hogy van vagy nincs szennyező, kristályos-amorf szerkezet

GC-MS Melléktermékek, rokonszennyezők, kiindulási anyag

HPLC-DAD Melléktermék,

rokonmolekulák, egyes szénhidrátok

Házi standard minősítése

Házi standard szintézis

• Házi standard szintézisének elve: minél olcsóbb, minél gyorsabb szintézisút

kidolgozása/megválasztása.

Kiindulási anyag metilészter etilészter izopropilészter AB-FUBINACA MMB-FUBINACA EMB-FUBINACA iPMB-FUBINACA ADB-FUBINACA MDMB-FUBINACA EDMB-FUBINACA iPDMB-FUBINACA

AB-CHMINACA MMB-CHMINACA EMB-CHMINACA iPMB-CHMINACA 5F-APP-PINACA 5F-MPP-PINACA 5F-EPP-PINACA 5F-iPPP-PINACA

Házi standard szintézis

• Egyszerű észteresítéssel 12 referencia anyagot jött

létre

• ATR-FTIR

• olvadáspont

• GCMS

• HPLC-DAD homogenitásvizsgálat (UV spektrum)

• NMR szerkezetazonosítás, kvantitatív NMR (qNMR)

Szintetizált házi standard

minősítése

2965.96

1735.21 1667.35

1510.62 1491.64

1310.51 1224.39 1172.17

749.39

500100015002000250030003500

Wavenumber cm-1

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

Absorbance Units ATR-FTIR

Példa: EMB-FUBINACA

40

A 12 vegyület észtercsoport karbonil részének ( νC=O) jelei az IR spektrumokban

1730-1740 cm^-1 tartományban éles, nagy intenzitású csúcsok

Hooke-törvény

izopropilészter <- etilészter <- metilészter

qNMR - belső standard módszer - gyakorlata Oldatkészítés (négy párhuzamos oldat):

Vizsgálandó anyag és a tőle eltérő kémiai szerkezetű, megfelelő minősítéssel rendelkező referencia anyag bemérése és oldása deuterizált oldószerben (pl.

dimetilszulfoxid-d6).

Vizsgálandó anyag koncentrációja Belső standard koncentrációja

1. minta

2. minta

3. minta

EMB-FUBINACA Maleinsav

4. minta

EMB-FUBINCACA mennyiségi referencia anyaggá minősítése

P– az adott protoncsoporthoz tartozó tisztaság/koncentráció

I – integrál értéke

N– a csúcshoz tartozó ekvivalens protonok száma

M– moláris tömeg

m– a bemért anyag tömege x– ismeretlen anyag

std – standard

EMB-FUBINACA tartalom:

95,92 ± 1,44%

2D-NMR elve

R. R. Ernst: Angew. Chem., 31, 805-823 (1992)

H. Kessler, M. Gehrke, C. Griesinger: Angew. Chem., 27, 490-536 (1988)

Az NSZKK NMR műszere

Etil-hexedron NMR vizsgálata

1 H

1 H

C14H21NO

13 C

zqs-clip-COSY (COrrelation SpectroscopY)

zqs-TOCSY

(TOtal Correlation SpectroscopY)

M. J. Trippleton, J. Keeler: Angew. Chem. Int. Ed., 42, 3938-3941 (2003) M. R. M. Koos, G. Kummerloewe, L. Kaltschnee, C. M. Thiele, B. Luy:

Angew. Chem. Int. Ed., 55, 7655-7659 (2016)

Homonukleáris technikák

zqs-easy-ROESY (Rotating frame Overhause Effect SpectroscopY )

S. Boros, Gy. Batta:

Offset-compensated and zero-quantum suppressed ROESY provides accurate 1H1H distances in small to medium-sized molecules Magn. Reson. Chem., 54, 947-952 (2016) DOI: 10.1002/mrc.4474

ed-HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)

HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Correlation)

Etil-hexedron *HCl

Formula Weight: 219,32264(Base) Exact Mass: 219,162314302 Molecular Formula: C₁₄H₂₁NO

9.60 9.10 8.08

7.76 7.61

5.28 2.90 1.82- 3.01

-2.00

0.74 1.26

1.16

1.00 1.26 1H-NMR chemical shifts δ [ppm]

7.8

7.4 7.2

7.2

J(H,H) couplinc constants [Hz]

Characteristic steric proximities detected by zqs-easy-ROESY

Characteristic heteronucler long-range coupling detected by HMBC method H C

13.5 11.2

25.6

21.9 29.4

60.5 41.2 128.8

129.2

134.0

134.8

196.4 13C-NMR chemical shifts δ [ppm]

HCl

N H O

CUMYL-CH-MEGACLONE

50 100 150 200 250 300 350 400 450 0

2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000 22000 24000 26000 28000 30000 32000 34000 36000 38000 40000 42000 44000 46000

m/ z-->

Abundance

Scan 1718 (19.458 min): 38583-11.D\ data.ms (-1702) (-) 280.1

197.0

91.0

41.0

398.3 155.0

326.9

430.1

238.0 479.0

N

N O

200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 0

2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000 22000 24000 26000 28000 30000 32000 34000 36000 38000 40000 42000

m/ z-->

Abundance

Scan 1716 (19.437 min): GCMS_CUMYL-CH-MeGaClone_from_herbs_HIFS.D\data.ms (-1687) (-) 280.1

197.1

398.2

250.9 311.9 326.9

221.1 295.9 355.0 377.1

N⁺

NH O

N

NH O

N

N O

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 0

2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000

m/z-->

Abundance

Scan 1716 (19.437 min): GCMS_CUMYL-CH-MeGaClone_from_herbs_HIFS.D\data.ms (-1687) (-)

91.0

118.0

103.0 41.0

77.0 178.9

55.0

168.1 155.0

135.0 66.0

C H₂ ⁺

C⁺

2921.39 2850.80

1713.03 1650.60 1614.60 1569.84 1556.87 1459.22 1444.29 1417.14 1404.74 1378.07 1361.35 1336.98 1284.47 1265.94 1251.55 1171.94 1133.70 1102.93 1077.66 1028.38 1017.40 962.60 788.46 773.43 764.09 749.88 738.57 709.01 695.36 686.02 667.94 643.37 618.19 610.97 595.73 559.36

1000150020002500300035004000

Wavenumber cm-1

0.010 0.020 0.030 0.040

Absorbance Units

IR sp ek tr u m (n ö vé n yr ő l le o ld o tt an ya g)

2923.27

1649.88 1571.12 1460.05 1361.70 1285.12 1172.46

788.71 764.24 750.14 738.84 695.38 562.55

500100015002000250030003500

Wavenumber cm-1

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Absorbance Units

IR sp ek tr u m (t isz tít o tt an ya g)

1 H-NMR spektrum

Molekulatömeg: 398

1 H-NMR spektrum, részletek

13 C-NMR és DEPT-135 spektrum

Zqs-clip-COSY és zqs-TOCSY spektrum

M. R. M. Koos, G. Kummerloewe, L. Kaltschnee, C. M. Thiele, B. Luy:

CLIP-COSY: A Clean In-Phase Experiment for the Rapid Acquisition of COSY-type Correlations

Angew. Chem. Int. Ed., 55, 7655-7659 (2016)

Zqs-NOESY spektrum

Multiplicitásszerkesztett HSQC spektrum

Ed-HSQC-TOCSY spektrum

HMBC spektrum

Formula Weight: 398,5399 Exact Mass: 398,2358136 Molecular Formula: C₂₇H₃₀N₂O

25.3 25.9

29.5

30.3 7.15 7.13 7.25

1.93

7.98 7.15

7.30 7.58

7.98

6.80

1.86 4.19

1.13 1.56 1.13

1.67

1.13 1.61

1H-NMR chemical shifts δ [ppm]

NT-07 in DMSO-d₆ solution

Steric proximities detected by NOESY method J(H,H) coupling

constants [Hz]

7.5

7.5

7.8

7.1 8.3

7.1 7.5 1.3

0.7

0.7

38.1

48.7 63.6

92.6 107.1

110.1 120.4 120.6

123.6

123.9

123.9

125.6 128.0

132.9

138.4

144.7

148.1 158.7

13C-NMR chemical shifts δ [ppm]

Heteronuclear long-range coupling detected by HMBC method H C

Ismeretlen anyag szerkezetvizsgálata

Molekulatömeg: 247 Etil-hexedron

Molekulatömeg: 219

* HCl

1 H-NMR spektrum

* HCl

13 C-NMR spektrum

* HCl

Ed-HSQC spektrum

HMBC spektrum

* HCl

* HCl

zqs-clip-COSY

spektrum

* HCl

zqs-TOCSY

spektrum

HSQC-zqs-clip-COSY spektrum

T. Gyöngyösi, I. Tímári, J. Haller, M. R. M. Koos, B. Luy, K. E. Kövér:

Boosting the NMR assignment of carbohydrates with clean in-phase correlation experiments Chem. Plus Chem., 83, 53-60 (2018)

* HCl

A szerkezet megoldása: butil-hexedron

* HCl

9.66 9.07 8.08

7.76 7.61

5.29 2.96 1.85- 2.80

-2.02

1.69

1.32

1.16 1.02 1.27

0.88

0.73 1H-NMR kémiai eltolódások δ [ppm]

O

N H

* HCl

13.5

19.4

21.9 25.7

27.5

29.4

60.9 45.8 128.8

129.2

134.0

134.8

196.4

13.5 13C-NMR kémiai eltolódások δ [ppm]

* HCl

HMBC méréssel talált jellemző heteronukleáris távolható csatolások H C

80

Köszönjük a figyelmet!

NMR frekvencia és érzékelység táblázat