Időfelbontásos lézerspektroszkópia

Időfelbontásos

lézerspektroszkópia

Cél: fluoreszcencia (v. foszforeszcencia-élettartam meghatározása,

Biológiában, anyagtudományban mikrokörnyezet vizsgálata

Ha több fluoreszkáló komponens van, ezek

elválasztása

Ha egy fluoreszkáló anyagot besugározunk, bizonyos számú molekula gerjesztődik

amikor a sugárzást megszüntetjük, a molekulák fokozatosan visszakerülnek az alapállapotba.

Ált. 1. rendű kinetika:

) ( )

) (

( k k N t

dt t dN

NR

R

 





N(t): gerj. molekulák száma a besug. után t idővel k_R: sugárzásos átmenet seb. állandója

k_NR: sugárzásmentes átmenet seb. állandója

t k

k_{R NR}

e N

N 



Integrálva:

 t

e N

N 



NR R

k k 

 1



Exponenciális lecsengés

A fluoreszcencia-intenzitás arányos N-nel.

 t I₀/e

I₀ I

gerj. imp.

Fluoreszcencia-intenzitás az idő függvényében a) Az impulzus rövid a lecseng. időáll.-hoz képest

 I t

I  ln

 ln

t lnI

 tg = -t/

Elvileg egyszerű,

de a jel-zaj viszony szempontjából kedvezőtlen!

(l. nemsokára)

b) Az impulzus hossza összemérhető a lecseng.

időáll.-val

Négyszög-impulzus (folyt. lézerből fényszaggatóval)

lézer-intenzitás

N(t)

10.1. Viszonylag hosszú időállandók (ms) meghatáro-zása - foszforeszcencia

- ritka földfémek emissziója

I: Folytonos lézer + fényszaggató + boxcar vagy elektrooptikai modulátor

vagy akusztooptikai modulátor II: Lézeres villanófényfotolízis

Megvalósítás I: boxcar-os rendszerrel

folytonos lézer

monokro- mátor

PMT

boxcar regiszt- ráló minta

fényszag- gató

lézer-intenzitás

N(t)

Miért kedvezőtlen a nagyon rövid gerj.

impulzus?

Kevés molekula gerjesztődik!

10. Villanófény-fotolízis

Villanófény-fotolízis

Foszfolipid vezikula kettősrétegében oldott porfirin triplett lecsengése oxigén jelenlétében.

Foszfolipid: sejtmembránokban található anyagok, hidrofil „fejjel” és lipofil „farokkal”

v e z i k u l a

F o s z f o l i p id k e t t õ s r é t e g

H i d r o f ó b s z e n z i b i l i z á t o r

Egy foszfolipid vezikula (idealizált) szerkezete, feltüntetve az apoláros próbamolekula legvalószínűbb helyét.

Triplett antracén abszorpciós spektruma A: hexánban, B: DMPC vezikulában 25^oC-on,

C: DMPC vezikulában 18^oC-on.

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

fényintenzitás megváltozása (mV)

-5E-05 5E-05 0.00015 0.00025 0.00035

idő (s)

CCl4 MK 31

Szingulett oxigénnel reagáló akceptor fogyása az akceptor abszorbanciájának mérésével.

0 0.006 0.012 0.018 0.024 0.03

IR intenzitás (V)

-0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

idő (m)s

A szingulett oxigén IR emissziós jele hematoporfirin szenzibilizátor jelenlétében. A megvastagított vonal extrapoláció.

11.1. Időkorrelált egyfoton-számlálás: ^egy

fényimpulzus gerjeszti a mintát, és a fluoreszcencia lecsengését vizsgáljuk az időben.

11.2. Fázismodulációs módszer: szinuszos intenzitás modulációt alkalmazunk, és a szintén

szinuszos intenzitás eloszlású fluoreszcencia fázis- eltolódását vizsgáljuk.

(Pumpa módszerek: külön tárgyaljuk Tulajdonképpen az impulzusos módszerhez tartozik.)I

11. Időfelbontásos fluoreszcencia-

spektroszkópiai módszerek

idő-ampl.

átalakító analóg-digitál

átalakító számítógép

impulzuslézer

minta

monokromátor trigger

PMT START

STOP

11.1.Időkorrelált egyfotonszámlálás

Mérőrendszer

A fényforrás impulzuslézer

START jel – lézernek és elektronikának Triggerrel vagy:

Az impulzus egy részét fényosztóval kicsatoljuk.

Fotodetektorra kerül, ez adja az elektronika indítóimpulzusát

(A lézerimpulzus másik része a mintára kerül)

Az indítóimpulzus az idő-amplitúdó átalakítón elindít egy feszültség-növekedést.

U

t STOP

START

Idő-amplitúdó átalakító

A mintából eredő lumineszcencia PMT-re kerül Úgy állítjuk be a gerj. fény intenzitását, hogy egyetlen foton váltson ki áramot a fotokatódon.

Amikor a PMT-ből származó impulzus eléri az idő-amplitúdó átalakítót, megáll U növekedése.

A kialakult jel arányos az eltelt idővel (a fluoreszc.

időkésésével).

Sok ezer, vagy 10ezer fényimpulzus után mérjük az első foton érkezési idejét

Többcsatornás analizátorral dolgozzuk fel.

gyakoriság

csatornaszám (idő)

A fluoreszc. élettartama ált. összemérhető a lézerimp. hosszával

 Dekonvolúció

E(t): a lézerimp. és a készülék együttes profilja F(t): a fl. lecsengése

L(t): a mért görbe (az előző kettő konvolúciója)

I(t)

t E(t)

L(t)

t d t

t F t

E t

L

t

    

  ^{( ) ( )}

) (

0

Níluskék festék fluoreszcencia-lecsengése toluolban

11.2. Fázismodulációs módszer

Folytonos lézer amplitúdóját szinuszosan moduláljuk.



fluoreszcencia Int.

t

Folytonos lézer Modulátor Minta

Monokromátor PMT

Lock-in

( fázisérzékeny detektor)

Referencia

jel szűrő

Fázismodulációs mérőrendszer

Két mérési eredményből is számítható

Fázisszögből:

tanΦ ωτ 

Demodulációból:

2 2τ ω 1

1 b/a

m B/A

 



Elsősorban impulzuslézerrel.

A mintára intenzív impulzust bocsátunk (pumpaimp.).

Molekulák egy része gerj. állapotba kerül.

A később érkező próbaimpulzus „észleli” a változást.

Időkésleltetés: optikai úthossz megnövelésével.

A fény 1 ns alatt 30 cm-t

1 ps alatt 0,3 mm-t tesz meg.

12. Pumpa-próba elvű módszerek

Impulzus lézerből

M

5-10%

próba pumpa

D

Optikai úthossz változtatás (s)

időkésés (t) saroktükör

Pumpa-próba mérés I: tranziens

abszorpció mérése egy lézerrel

t Próbanyaláb

intenzitása

a r g o n l é z e r

R 6 G f e s t é k l é z e r D C M f e s t é k l é z e r

f é n y - o s z t ó

s a r o k t ü k ö r

d i k r o i k u s t ü k ö r

m i n t a

d e t e k t o r p u m p a s u g á r

p r ó b a s u g á r 1 0 - 2 0 p s

1 0 0 0 0 p s

Pumpa-próba kísérlet II:

Tranziens abszorpció két lézerrel

0 0.00002 0.00004 0.00006

620 640 660  [nm]

J el

Níluskék metanolos oldatának tranziens abszorpciója pumpa-próba módszerrel mérve (_pumpa = 586 nm)

0 50 100

0 500 1000 t [ps]

Níluskék tranziens absz. lecsengése vizes oldatban pumpa- próba módszerrel mérve (_pumpa = 586 nm, _próba = 647 nm)

Pumpa-próba Módszer III: tranziens emisszió mérésére:

„Fluorescence up-conversion”

Femtoszekundumos folyamatok vizsgálatára használható

Ti-zafír lézer

BBO dikroikus tükör

minta

saroktükör

BBO szűrő

szűrő

mono- kromátor

PMT

 

2

_F

+_F

DCM lézerfesték fluoreszcencia-lecsengése etilénglikolban

P. van der Meulen, J.Phys. Chem. 100, 5367 (1996)

Magyarázat: a kisebb hullámhosszakon gerjeszthető S₂, S₃ állapotokból töltődik fel az S₁

O CN NC

CH₃

N CH₃ CH₃

13-14. Lézer-Raman spektroszkópia

A Raman-effektus már a lézerek felfedezése előtt ismert volt.

1922 Brillouin Fény és hanghullámok kölcsönhatása 1923 Smekal Raman-szórás elmélete

1928 Raman Kísérleti igazolás

13.1. Hagyományos Raman-spektroszkópia 13.2. Rezonancia-Raman effektus

13.3. Felületerősített Raman-szórás

14.1. Hiper Raman-effektus

14.2. Stimulált Raman-effektus

14.3. Raman erősítési spektroszkópia

14.4. Koherens anti-Stokes Raman-spektroszkópia

Spektrumok

TARTALOM

A Raman-spektrum az IR és mikrohull. spektrum kiegészítője.

Főleg rezgési és forgási spektrumok mérésére 13.1 Hagyományos Raman-spektroszkópia

A lézerek előtt a R-spektroszkópia fejlődését

gátolta, hogy nem volt intenzív monokromatikus fényforrás.

Főleg higanygőzlámpát használtak (a 254 nm-es vonalát).

A lézerek leterjedése - minőségi ugrás

R-szórás: a foton rugalmatlan ütközése a molekulával.

_s

b a

_L

_s

b a

_L

Stokes Anti-Stokes

Készülék:

- Diszperziós: hasonló a spektrofluoriméterhez.

Monokromátor: két rács (nagyobb felbontás kell)

- Fourier-transzformációs Raman: monokromátor helyett interferométer

J e l f e l d o l g o z ó e l e k t r o n i k a

F o t o e le k t r o n s o k s z o r o z ó F o l y t o n o s lé z e r

K é t r á c s o s m o n o k r o m á t o r

M in t a

S t o p

Diszperziós Raman-spektrométer

Nd-YAG lézer mozgó tükör álló tükör

minta

detektor fényosztó

FT-Raman spektrométer

szűrők

Antracén Raman-színképe (A) Diszperziós Raman-készülék, _exc=514,5 nm (B) FT-Raman készülék, _exc=1064 nm

Chase, J. Am. Chem. Soc. 108, 7486 (1986)

Raman és infra összehasonlítása Raman előnyei

Vizes oldatok Optika üvegből

Kisebb minta (fókuszálás) Detektor gyorsabb

Raman-spektrum egyszerűbb Szimm. rezgések R-aktívak Polarizációs mérések

Intenzitás arányos konc.-val Kis hullámszámok

tartománya is mérhető

Raman hátrányai Drágább

R-spektrum készülékfüggőbb Infra érzékenyebb

Fluoreszcencia zavaró hatása

Raman-mikroszkóp

Búzaszem

13.2. Rezonancia-Raman effektus

Ha a Raman-átmenet felső szintje nem virtuális,

hanem valóságos, akkor a Raman-intenzitás megnő.

Speciális Raman-módszerek

Ha a minta fluoreszkál, nehéz detektálni a Raman- jelet.

Emberi vér rezonancia Raman-színképe az O₂ telítettség függvényében

artériás vér: a) hemoglobin O2 telítettség 99 %, vénás vér: b) 78 %, c) 68 %, d) 26 %

K. R. Ward, Anal. Chem. 79, 1514 (2007)

13.3. Felületerősített Raman-szórás

(Surface Enhanced Raman Scattering - SERS) Érdes felületen adszorbeált molekulák Raman- intenzitása nagyságrendekkel nőhet..

Először Ag felületén adszorbeált piridinen észlelték 1974-ben.

6 nagyságrend érz. növekedés is elérhető.

Akkor lép fel, ha a mintára lépő foton energiája megegyezik egy, a fémben lévő vezetési

elektronenergia-átmenetével.

Furfural adszorpciója kolloid ezüstön

Raman-színkép (a) oldatban, (b) kolloid ezüstön

T.-J. Jia, J. Mol. Struct. (2007)

O

O H

14.1. Hiper Raman-effektus: két foton egyidejű rugalmatlan ütközése

b a

_L

_L

b a

_AS

_L

_L

Stokes anti-Stokes

E = 2h_L -h_S

Frekvencia-kettőzés : hiper-Rayleigh szórás A hiper Raman-effektus nehezen észlelhető - nagy lézer-intenzitás kell.

Mások a kivál. szabályok, mint a normál

Ramanban. Olyan átmenetek is tanulmányozhatók, amelyek infra- és Raman-inaktívak.

14.2. Stimulált Raman-effektus

virtuális E szint

h_L

h_S

a b

2h_S

Véletlenül fedezték fel.

Woodbury és Ng Rubinlézer Q-kapcsolását tanulmányozták.

Nitrobenzolt tart. cella

Kevesebb piros (694,3 nm) fény jött ki, mint várták.

766 nm-es koherens fényt találtak.

A különbség megfelel a nitrobenzol 1350 cm^-1 rezg. frekv.-jának.

Magyarázat: a kezdetben spontán Raman-

emisszióval keletkező Stokes-fotonok a sugárzás irányában újabb Stokes-fotonokat váltanak ki.

h_L h_L

h_S

A Stimulált Raman-effektuson alapul több nem- lineáris Raman-spektroszkópiai módszer.

Önmagában nem terjedt el.

Csak a legerősebb Raman-átmenetek figyelhetők meg - versengés.

oszcillátor

^L

^L

^S generátor

^S

tükör tükör

"Raman lézer"

^S ^S

^L ^L

er ősítő modell

^L

gyengül,

^S erősödik

Kísérleti megvalósítások

Erősítő: nincs küszöb, a teljes spektrumot mérhetjük

14.3. Raman erősítési spektroszkópia

„Stimulated Raman gain”: _S-t mérjük Inverz Raman: _L-t mérjük

lézer

lézer

_S

_S

_L

_L

detektor Dikroikus

tükör minta

Előny: nem kell monokromátor (az egyik lézert hangoljuk).

Felbontást a lézerek sávszélessége határozza meg.

Inverz Raman: a nagyobb frekv. fényt detektáljuk - fluoreszcencia zavarásának kiküszöbölése

Felhasználás: nagyfelbontású Raman spektroszkópia

5-CB folyadékkristály inverz Raman-színképe

Az 5-CB 1606 cm—es inverz Raman jelének intenzitása négyszögfeszültséget kapcsolva a mintára

14.4. Koherens anti-Stokes Raman-spektroszkópia

„Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy”

CARS

Négy foton vesz részt a folyamatban

Kettőt elnyel, kettőt kibocsát a molekula Visszajut a kiind. energiaállapotba.

CARS alapkísérlet

Imp.lézer

_L _L

_L, _S

_AS folyadék

Nómenklatúra:



 



 



 

_L _AS _L ₂

₁ ₁ ₃

Termdiagram

Energia-megmaradás: 2



= 

+

_S

a b

Indexillesztés:

Kondenzált fázisban a törésmutatók különböznek (függvényében)

Ha kollineáris sugarakat használunk, a jel nagyon gyenge.

Impulzus-megmaradás törvényének is teljesülnie kell.

Hullámvektor:

i i

i i

i

i

c

n c

k  n    _~

2 2







 

Hullámszám az anyagban

k 

k 

k 

Folyadék- fázisban

k 

k 

k 

k 

Gázfázisban

k 

A lézersugarakat a mintára fókuszáljuk

k 

k 

k 

PMT

fényosztó ₃ ₂

Ar-lézer hangolható

festéklézer minta ₁

Berendezés vázlata

Spontán Raman és CARS összehasonlítása

Spontán Raman CARS

10⁶-10⁸ foton kell egy szórt foton előállításához

10²-10³ foton elég

Inkoherens, csak egy részét gyűjtjük össze

Koherens, 90 %-os hatás- fokkal összegyűjthető

Felbontást a mono- kromátor limitálja

Jel ~ I₁²·I₂·c² Jel ~ I_L·c

Felbontást a lézerek sáv- szélessége limitálja

Spektrumok

A kloroform Raman(a) és IR (b) spektruma

C₆₀ FT-Raman spektruma

Kétatomos molekula rotációs energianívói:

] [

) 1 8 ² (

2

Joule J

I J

E_J  h 



] [

) 1 8 (

1 2





 J J cm

Ic h hc

E

J





A spektroszkópiában gyakran cm^-1-ben fejezik ki az energia-külöbségeket:

Itt a fénysebességet cm/s-ban kell behelyettesíteni.

] [

) 1

( 





 B J J cm



J _J 0 0

1 2B

2 6B

3 12B

4 20B

] [

) 1

( 





 B J J cm



Kiválasztási szabályok:

J = 0,  2

Kétatomos molekula

rotációs energia-nívói és a Raman-átmenetek

Kétatomos molekula Raman-spektruma

O₂ tiszta rotációs inverz Raman- spektruma

O₂ rezgési-forgási Q- ágának nagyfelbontású Raman-erősítési

spektruma

SF₆ rezgési-forgási Q-ágának nagyfelbontású Raman- erősítési spektruma