BIOREAKTOROK és a MÉRNÖKI GYAKORLAT

BIOREAKTOROK és a MÉRNÖKI GYAKORLAT

Előadás:

•tanári

•hallgatói ea (Hallg(50%).+tanári értékelés(50%).

(benne javasolt vizsgakérdés!)

•70% jelenlét, katalógus

Labor: 1 hetes (50%)+1napos(50%)

Előadások

MSc

ENZIMES ÖSSZEFOGLALÓ 2012

Egy egység az az enzim mennyiség, amely 1 mol szubsztrátot alakít át vagy 1 mol terméket képez 1 perc alatt adott reakció

körülmények között.

E + S P + E mol/dm³!!!!

E/tf E/mg fajlagos aktivitás

MIÉRT NEM MÉRHETŐ MIÉRT NEM MÉRHETŐ ? ?

Michaelis és Menten SI rendszerben: 1 Katal: 1 mol szubsztrátot alakít át 1 s alatt.

hatalmas enzim mennyiség nKat = 10^-9 Kat

1 Kat = 6*10⁷ U, 1U =1.6*10^-8 Kat, 1U= 1/60 Kat

Michaelis-Menten kinetika

E + S ES E + P^k1

k_-1

k₂ k_-2

(ES) S.E k

K k

1 s  ^1  feltételezések: *k_-2 =0

*első lépés gyorsan egyensúlyra jut= RAPID EKVILIBRIUM

*stabil ES komplex, EP komplex elhanyagolható

*egy aktiv centrum, egy szubsztrát aktivitás helyett cc használható

S E₀ vagyis E₀ / S < <1 k₁SE = k_-1 (ES)

az (ES) disszociációs állandója

V dP

dt k (ES)₂

 

E (ES)   E

a „minket érdeklő” reakciósebesség:

anyagmérleg osszuk el ezt a kettőt egymással

Michaelis-Menten kinetika

(ES) S.E k

K k

1 s  ^1 

V E

k (ES) E (ES)

o





V E

k S

K E

E S

K E

o

2 s

s





S K

S K

1 S K

S E

k V

s s

s o

2  





V_max  k E_{2 o}

V dP

dt k (ES)₂

 

Rendezzük át!

BRIGGS-HALDANE KINETIKA

 

     

 

dt k dP

ES k

ES k

ES dt k

ES d

ES k

ES dt k

dS

2

2 1

1

1 1



















S   Eo

pre-st.st.

S

P (ES)

E S₀

E₀

0 idõ

kvázi st.st.

d(ES)/dt =0 steady state

E + S ES E + P^k1

k_-1

k₂ k_-2

NAGYON RÖVID IDŐ HOSSZÚ IDŐ

PRE-STEADY STATE

BRIGGS-HALDANE KINETIKA

 

 

 

dt ES d

2 1

1   

 _

K_m=(k_-1 + k₂) / k₁

E (ES) E  _o

  

  



2 1

1

k k

ES ES k

ES k

k ES

k

 









Michaelis állandó

S K

V S S

K

S E V k

m max

m o 2

 

 

DISZKUSSZIÓ

Michaelis -Menten Briggs-Haldane

V V S

K S

max s

  ^{V V}

S

K S

max

m

 

K k k

k

k k

k

k K k

m 1 2 k

1

1 1

2 1

s 2

1

 

   

 

ha num(k₁)> >num(k₂) a két konst. azonos!

V=(V_max/K_S)*S

1.rendû tartomány

0.

rendű

tartomány V_max= k₂E_O

V

K_m ; K_S S

DISZKUSSZIÓ

V=(V_max/K_S)*S

1.rendû tartomány

0.

rendû

tartomány V_max= k₂E_O

V

K_m ; K_S S

S  Ks

Ha S  Ks derékszögű hiperbola

látszólagos elsőrendű sebességi állandó

S E k S K E

V k _{0 0}

S

2  



katalitikus effektivitás= specfi(ci)tás állandó

V V S K S

max

s

 

K_m/V_max= specfi(ci)tás idő

L-B, L-H, E-H ábrázolások

-1/K

1/S

tg=K_m/V_max

1/V

V_max

1 1 1

V V Km

V S

 

max max*

tg=1/V_max

S/V

S K

/V

K

S

V Km

V V S

 

max max 1 *

V

V/S V_max

tg=-K_m

V_max/K_m

S m V max K

V

V  

V

értelmezése

V₀=

( ^dS/dt )

S

t

P

t

V₀=

( ^dP/dt )

A M-M és B-H egyenletekben A M-M és B-H egyenletekben

V kezdeti reakciósebességet jelent!!!

V kezdeti reakciósebességet jelent!!!

A k

meghatározása és V

E

-függése

V_max3=k₂E_O3 V_max2=k₂E_O2 V_max1=k₂E_O1

K_m S E_O1 E_O2 E_O3 E_O

V

tg = k

A kinetikai paraméterek értelmezése 1 V_max IUBMB:nem max, hanem limit!!! HATÁRSEBESSÉG

k_cat: [ s^-1 ]

Egy enzimmolekula átalakítási frekvenciája S-telítés esetén

NEM ENZIMTULAJDONSÁG V_max= k₂ . E0 = AKTIVITÁS k₂ [s^-1]

ENZIMTULAJDONSÁG = turnover number, váltásszám

V_max= k_cat . E₀

Kiterjesztés minden enzimre és minden kinetikára

K_m , K_S

-Közelítőleg az S az élő sejtben - az enzim affinitása

- A = B ???

-Változott a K_S Inhibitor?Aktivátor?

-Enzimanalitika S>>KS

Túl érzékeny

érzéketlen

A kinetikai paraméterek értelmezése 2

k₁ 10⁷-10¹⁰ dm³mol^-1min^-1

max. érték(10¹¹) kis molekulák diffúzió-sebessége  k_-1 10²-10⁶ min^-1

k₂ 50-10⁷ min^-1

K_m 10^-6 - 10^-2 mol/dm³

katalitikus effektivitás= specfi(ci)tás állandó

M 10

1s 1M

s M 10

s K 10

k

7 1 1

7 1

1 7 m

cat





 



 



Legtöbb enzim e két szélső eset között

k_cat alsó határa metabolikus enzimeknél

Természetes enzimeknél: >10⁵

Mesterséges e-nél (DNA-zyme, abzyme:<10³

<10⁸-10⁹ M^-1s^-1

diffúziókontrollált bimolekuláris reakció

ENZIM MODULÁCIÓ

INHIBÍCIÓ

V_max

E_O

REVERZIBILIS IRREVERZIBILIS

E + S ES E + P +

I E I

DINAMIKUS EI ^KOMPLEX

LINEÁRIS INHIBÍCIÓ komplett k_P

NEMLINEÁRIS INHIBÍCIÓ (HIPERBOLIKUS)

részleges βk_P „csökkent, maradék aktivitás”

1/V - I

ábrázolás

DIXON ábrázolás

KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

VERSENGÉS S ÉS I KÖZÖTT AZ E AKTÍV HELYÉÉRT, VAGY...

KÖLCSÖNÖS KIZÁRÁS I szubsztrát analóg alternatív szubsztrát termék

MODELLEK

1. MODELL: Klasszikus kompetitív inhibíció

Az I verseng S-sel ugyanazon aktív hely elfoglalásáért 2.-3 MODELL: sztérikus GÁTLÁS

4. MODELL: átlapoló helyek esete :1 és 3 kötő hely képes az i, a 2 és 4 kötő hely pedig az S megkötésére, de egymást kölcsönösen

kizárják

5. MODELL: I kötõdése az enzimhez konformáció változást okoz az enzimen és ez megakadályozza S-nek az aktív centrumhoz kötődését. Ilyen a végtermék gátlás (feed back inhibíció) is.

1. KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 5.

1. KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 6.

S 1 K 1 I V

K V

1 V

1

I max

S

max 

 



 





K S 1 I

K V S

V

i s

max

 



 



 



K S 1 P

K V S

V

P s

max

 



 



 



2 1 S 1 2

S 1max 1

1

K S 1 S

K V S

V

 



 



 



kompetitiv inhibició

k. termék inhibició

alternativ v. versengő szubsztrátok

1 2 S 2 1

S 2max 2

2

K S 1 S

K V S

V

 



 



 



ANALÓGIÁK

NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

K_s

k_p

E + S ES E + P

+ +

I I

K_i K_s

EI + S ESI

K_i

K_S

K_S K_I

K_I

V V

ES

E ES EI ESI

max

   

2. NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

V V

S K

1 S

K

I K

S.I K K vagy

V V

S

K 1 I

K S 1 I

K illetve

V = V 1

1 I

K

S

K S

max

s

s i s i

max

s

i i

max

i

s



  



 

 

   

 



 

 

 

Az inhibitor a látszólagos V_max értéket változtatja meg, K_s (illetve K_m) értékét nem befolyásolja.

V 1/V

0 1/S

 ¹

Vmax 1

Vmaxi 1 I

Ki Vmax



 K

V 1 I K

m

max i

 

 



K V

m max

I

V_max V_maxi

I

K_m S

3. UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 1

Ks kp

E + S ES

K_s k_p

E + P +

I

ESI

I csak az ES-hez kötődik

I kötő hely

„nem kész”

I kötő hely

„ kész”

S kötő hely eltorzult

3. UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 2

V V

S K 1 S

K

SI

max K K

s

s s i



 

V V S

K S 1 I K

max

s i



  

 



mi változott?

S K

1 I K

S K

1 I V 1 V

i S i

max 



 



 







l.nemkomp.inh.

a komp forditottja, K_S csökken

Egy unkompetitiv

I

3. UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 3

1 V

K V

1 S

1

V 1 I K

m

max max i

   

  

 

V V 1

1 I K

S K 1 I

K

max S

i

m

i







 

 





V_max/2 V_maxi/2

V_max V_maxi

I

V V

1 I K

maxi

max

i





K K

1 I K

mi

m

i





K_m V

S

I

nem inhibeált

1/S 1/V

I

K_m/V_max

1/V_max

1 1

V

I K

i V

i

max max







 1 I

K K

i m

1/K_m

LINEÁRIS KEVERT TIP. INHIBICIÓ

   

K 1

K K

1

K K

eq

s i i s

 

 

I JELENLÉTE MÓDOSITJA S^-NEK ES-RŐL TÖRTÉNŐ DISSZOCIÁCIÓJÁT

l. nemkomp!!!

DE

E + S ES E + P + +

I I

EI + S ESI K_S

K_S

K_I K_I

k_P

ahol K_S=E.S/ES,

K_S=EI.S/ESI K_I=E.I/EI

K_I=ES.I/ESI

E ES ESI E EI ESI

LINEÁRIS KEVERT TIP. INHIBICIÓ 2

 

V V

S K 1 S

K

I K

S.I K K

vagy kissé átalakítva

V V S

K 1 I

K S 1 I

K

vagy

V =V 1

1 I K

S

K

1 I K 1 I K

S

max

s

s i s i

max

s i i

max

I s I

I



  



 

 

   

 



 

 







 

 















L. NEMKOMP!!!

nemkomp

unkomp komp

LINEÁRIS KEVERT TIP. INHIBICIÓ 3

V_max/2 V_maxi/2

V_max V_maxi

I

V V

1 I K

maxi max

i

 

 K_mi

V

S

I

nem inhibeált

1/S 1/V

I

1 1

V

I K

i V

i

max max









 

 

 1

1 I K

K I

K

i m

i



-1/K_m

K_{m -1/Km}

K V

I K

m

i max

1



 



1 1

V_max





 

 



1 I K V

 i max

INHIBICIÓK ÖSSZEFOGLALÁSA

S és I kölcsönösen kizárják egymást az enzimről KOMPETITIV

S és I egymástól függetlenül kötődnek az enzimre NEMKOMPETITIV

mint előző, de az I megváltoztatja az enzim affinitását KEVERT TIPUSÚ I csak a S után kötődik UNKOMPETITIV

SZUBSZTRÁT INHIBICIÓ

• -- A szubsztrátnak ahhoz, hogy termékképző átmeneti komplex jöjjön létre, két vagy több helyen kell, hogy az enzimhez kötődjék.

Sok S molekula → egy S molekula az egyik,

másik S molekula pedig egy másik

kötőhelyhez kapcsolódik s így inaktív komplexek jönnek létre (ez is reverzibilis inhibíció).

E

-OOC

CH₂ CH₂

-OOC

E

-OOC

CH CH

-OOC

Succinate Malonate

E

-OOCCH₂CH₂COO^-

-OOCCH₂CH₂COO^-

Normal S inhibition

■■-- Nagy S koncentrációnál egy S molekula olyan köt-- Nagy S koncentrációnál egy S molekula olyan kötőőhelyhez is kapcsolódhat az helyhez is kapcsolódhat az enzimen, amely nem az aktív centrum része, az ilyen köt

enzimen, amely nem az aktív centrum része, az ilyen kötődés mintegy ődés mintegy NEMKOMPETITIV

NEMKOMPETITIV (v. unkompetitiv) (v. unkompetitiv) módon megakadályozza a normális S módon megakadályozza a normális S kötkötőődést.dést.

■■--Az enzim m--Az enzim műűködéshez szükség lehet egy aktivátor molekulára. Ha ez kapcsolódni ködéshez szükség lehet egy aktivátor molekulára. Ha ez kapcsolódni képes a szubsztráttal, sok S molekula

képes a szubsztráttal, sok S molekula "elvonja" az enzimtő"elvonja" az enzimtől az aktivátortl az aktivátort, így , így csökkentve annak tényleges aktivitását.

csökkentve annak tényleges aktivitását.

■--Két (vagy több) szubsztrátos re■--Két (vagy több) szubsztrátos reakciók esetén az egyik szubsztrát feleslege lekötheti akciók esetén az egyik szubsztrát feleslege lekötheti a másik szubsztrát köt

a másik szubsztrát kötőő helyeit, megakadályozva a szükséges második szubsztrát helyeit, megakadályozva a szükséges második szubsztrát kapcsolódását, így megintcsak inaktív komplexek jönnek létre.

kapcsolódását, így megintcsak inaktív komplexek jönnek létre.

■-- ■-- NNagy S koncentráció aspecifikus módon is gátolhatja a reakciót, például az agy S koncentráció aspecifikus módon is gátolhatja a reakciót, például az ioner

ionerősség megnövekedése miatt.ősség megnövekedése miatt.

SZUBSZTRÁT INHIBICIÓ

K a

S S

1 K V 1

= V

s max s

 



SZUBSZTRÁT INHIBICIÓ

V

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

0 50 100 150 200 250 300

V_max=0.9,Ks=50,K_i=10 V_max=0.9,Ks=50,K_i=50

V_max=0.9,Ks=50,K_i=100

Szubsztrát koncentráció (mg/L)

A.)Termékképzéshez egyszerre több különbözõ szubsztrát kell, hexokináz

glükóz + (Mg)ATP Glükóz-6-foszfát + (Mg)ADP foszforilezés

két termék

B.) A másik esetben a reakció keverékben egy enzim és több különböző, lényegében alternatív szubsztrát.

példák: a legtöbb biopolimer hidrolizáló enzim

amiláz, amilo-glikozidázok, cellulázok

proteinázok.

Függetlenül attól, hogy ezekben az esetekben exo- vagy endo-enzimekről van-e szó, a reakció-keverékben egyidejűleg több, különböző polimerizációs fokú szubsztrát van (lesz) jelen.

TÖBB SZUBSZTRÁTOS REAKCIÓK

MSc 2009

Két tipus

EGYÉB HATÁSOK AZ ENZIMAKTIVITÁSRA Ionerősség

pH

Hőmérséklet Nyírás

Nyomás (hidrosztatikai) Felületi feszültség

Kémiai szerek (alkohol, urea, H₂O₂...) Fény, hang, ionizáló sugárzások

REVERZIBILIS

VÁLTOZÁSOK IRREVERZIBILIS

Y_i

pH 1

Y

Y^-

Y^2-

Y 1

1 H / K₁ K / H₂



 

  

Y= Y^2-= pH hatása 2

 





2 1 optimum

pK 2 pK

pH 1

K K H





 

!









 

 1 H /K K /H

E 1 k Y

E k V

2 1

0 2 0

2 max

pH hatása 2

Hőmérséklet hatása



 



  



 



 

 



 



 



 R

exp S RT

exp H RT

exp G E K

E _{d d d}

d a

i

 

 

E E

1 K é s V k T E ahol

k T k T

h e e

a 0

d max 2 a

B S /R^* E/RT

  

 





  ^

2  ^

Kettős hatás Reakciósebesség nő

Csökken: denaturálódás

irreverzibilis reverzibilis

E_a E_i K_d

Mivel E₀ = E_a + E_i

V Te

1 e e

max

E/RT

S / R^* H /RT_d

  







 

 = kombináció (β,k_B,h,E₀,S*) K_m is függ T-től!

1,8 1,9 2,0 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6

2,9 3,1 3,3 3,5 3,7 V

Oxigén képzõdési sebesség cm³/min

1/T*10³

Hőmérséklet hatása

a

kE

dt

dE  

Időtől is függ!

  _a0 ^kt

a t E e

E  ^

 

a

t E e

E 

β

R E tg H^d 







R tg  E





REVERZIBILIS REAKCIÓK 1

Sok enzim katalizálta reakció - főként a biopolimer hidrolízisek - nagymértékben a jobboldali irányba eltolt egyensúllyal rendelkeznek,

→

De például a glükóz fruktóz (glükóz izomeráz)gyakorlatban is egyensúlyi reakcióként viselkedik

E + S ES E + P k₁

k_-1

k₂ k_-2

K k k

k

K k k

k

ms 2 1

1

mp 2 1

2

 

 







V k E V k E

maxs 2 o

maxp 1 o





2 1

2 1 2

1 um)

eq(uilibri

2 2 2

1 1 1

k k

k K k

K K

k K k

k

K k

















1/K_S K_P

REVERZIBILIS REAKCIÓK 2

Végezzük el a következő osztásokat:

V K

k k E

k k és V K

k k E k k

maxs ms

1 2 o

2 1

maxp mp

2 1 o

2 1

  





 



V K V

K

V K V K

k k

k k K

maxs ms maxp

mp

maxs mp maxp ms

1 2

1 2

   eq

 

HALDANE összefüggés

REVERZIBILIS REAKCIÓK 3

E

MI TÖRTÉNIK?

S → P vagy P → S

?

S

P MITŐL FÜGG? K

, S , P értéke

V

V S P

K

K 1 P

K S

V S

K V P

K

1 S

K

P K

netto

maxs

eq

ms

mp

maxs

ms

maxP

mP

ms mP



 

 



 

 

 





 

V

= V

- V

= k

(ES) - k

(EP)

mP mS

0 P 0

s

K P K

1 S

P E k

S E k







Ahol:

a

2 1

2 1 P

2 1

2 1 S

k

k k

k k k

k és k

k k k

 

 









mP mS

0 P 0

A

K p K

1 a

p E k

a E k







MCA